2. 桂林医学院, 广西桂林 541004;
3. 桂林理工大学, 广西桂林 541006
2. Guilin Medical University, Guilin, Guangxi, 541004, China;
3. Guilin University of Technology, Guilin, Guangxi, 541006, China
玉米苞叶是玉米的外苞叶。据统计2016年我国玉米播种面积36 759.7万hm2 [1]。每公顷玉米可采收约600 kg苞叶，中国一年玉米苞叶总产量约22 05.582万t[2]。玉米苞叶是一种资源非常丰富的农副产物。目前，玉米苞叶主要用于畜牧饲料、燃料、编制工艺品等[3]。利用玉米苞叶进行深加工的相关报道有提取黄酮类化合物[4]、膳食纤维[5]、多糖[6]等。玉米苞叶中的细胞壁半纤维素主要由木聚糖构成[7]，木聚糖是植物细胞壁的主要组成成分之一，其含量仅次于纤维素，由β-(1→4)连接的木糖残基构成主链，主链木糖基的2，3 C通常还链接不同取代基。据研究报道木聚糖提取物可增强免疫力[8]、抗肿瘤[9]、抗氧化[10]、降血糖[11]、降血脂[12]、预防和治疗心血管疾病[13-14]。以木聚糖为平台化合物可生产木糖、木糖醇、低聚木糖[15]，上述功能糖都是肠道微生物的益生元，可促进乳酸菌和双歧杆菌增值[16]，木糖醇可改善糖尿病症状和治疗肺部感染[17]。
碱法提取是目前从农副产品废料中提取木聚糖普遍采用的制备工艺[18-21]。木聚糖是玉米苞叶生物炼制产业链的关键平台化合物，至今未见相关报道。响应面法(RSM)已被广泛用于生物化工工艺优化。本研究在单因素试验基础上，采用响应面法进一步综合分析影响碱法提取玉米苞叶木聚糖提取率的关键因素，确定最佳工艺参数，为玉米苞叶高值化利用和资源深加工提供基础研究资料。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器新鲜玉米苞叶购于广西桂林市雁山区农贸市场。将玉米苞叶剪碎，至于80℃烘箱中干燥至恒重，后粉粹备用。木糖(优级纯)、氢氧化钠(分析纯)、浓硫酸(分析纯)等购自上海国药化学试剂有限公司。恒温水浴锅(北京科学长安仪器公司)，30 L高压灭菌锅(上海博迅实业有限公司)，Precisa水分分析仪XM 60(普利赛斯国际贸易上海有限公司)，高效液相色谱仪(HPLC)、控制器CBM-20A、泵LC-20AT，RID-10A示差折光检测器等购自日本岛津公司。
1.2 方法 1.2.1 木聚糖提取工艺流程流程：玉米苞叶→粉粹→碱提→真空抽滤→木聚糖粗提液。
工艺要点：称10 g(绝干重量)玉米苞叶，添加碱液100 mL，搅拌器混匀，置于恒温水浴摇床锅中进行提取，提取时间根据后续试验条件1.2.3节的方法进行设置，提取前称重，提取结束补水至起始重量，然后取布式漏斗，垫100目塑料滤网，抽真空状态下过滤样品，滤出液即为木聚糖粗提物。
1.2.2 木聚糖的测定采用高效液相色谱法检测[22]，检测条件：Transnomic Ca2+色谱柱，柱温85℃，流动相为超纯水，流速0.5 mL/min，RID-10A示差折光检测器，进样量20 μL。
将1.2.1节获得的木聚糖粗提物采用稀硫酸中和pH值至7.0，定容至100 mL，取20 mL中和液，添加2 mL 15%硫酸，混匀，置于121℃水解90 min后，添加去离子水定容至V1=100 mL，水解液10 000 r/min离心10 min，留上清液。取10 mL上清液加入20 mg粉末活性炭(烘至恒重)，再加混合树脂(阴离子树脂:阳离子树脂=2:1，已经经过10 000 r/min离心去除树脂中游离水)脱盐，使样品电导率≤5 μs/cm3，过0.22 μm水系微孔滤膜过滤后进行HPLC检测，根据标准曲线换算得木糖浓度ρ(g/L)，则木聚糖含量m为
m=ρ×V1×5×K1×0.88，
式中：V1为粗提物中和定容后的总体积100 mL，5为稀释倍数，K1为树脂和粉末活性炭对糖的吸附系数。吸附系数K1计算：配置2 g/L木糖，检测添加活性炭和树脂制样前后的峰面积比值(做3个平行)。经分析可知活性炭和树脂的吸附系数K1=1.366±0.001(n=3)。0.88为单糖换算聚糖系数[23]。
木聚糖提取率(%)=m/M×100%，
式中：m为木聚糖质量g；M为原料绝干重量g。
1.2.3 玉米苞叶木聚糖单因素试验 1.2.3.1 碱液浓度对木聚糖提取率的影响称10 g(绝干重量)玉米苞叶9份，添加碱液100 mL，碱选择氢氧化钠，质量浓度分别为4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%，提取时间24 h，提取结束后真空抽滤，滤液按照1.2.2节方法进行木聚糖测定，并计算木聚糖提取率。
1.2.3.2 提取温度对木聚糖提取率的影响称10 g(绝干重量)玉米苞叶8份，添加碱液100 mL，碱液浓度按照1.2.3.1节最优条件执行，提取温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，提取时间24 h，提取结束后真空抽滤，滤液按照1.2.2节方法进行木聚糖测定，并计算木聚糖提取率。
1.2.3.3 提取时间对木聚糖提取率的影响称10 g(绝干重量)玉米苞叶8份，添加碱液100 mL，碱液浓度和提取温度分别按照1.2.3.1节和1.2.3.2节最优条件设置，提取时间分别为6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h，提取结束后真空抽滤，滤液按照1.2.2节方法进行木聚糖测定，并计算木聚糖提取率。
1.2.4 玉米苞叶木聚糖提取工艺响应面法优化试验在单因素试验结果基础上，采用中心组合试验Box-Behnken设计方案做进一步优化。模型通过最小二乘法拟合二次多项方程可以表达为Y=A0+∑AiXi+∑AiiXi2+∑AijXiXj，以木聚糖提取率为指标，设计3因素3水平响应面分析试验，试验因素见表 1，根据Design-Expert 7.0软件分析确定最优发酵工艺参数。
| 因素 Variables |
编码值 Variable symbol |
水平Levels | ||
| -1 | 0 | +1 | ||
| 氢氧化钠NaOH (%) | A | 6 | 8 | 10 |
| 温度Temperature (℃) | B | 60 | 80 | 100 |
| 时间Time (h) | C | 12 | 18 | 24 |
1.2.5 数据统计分析
试验采用Design-Expert 7.0软件进行统计分析，P < 0.05表示具有统计学意义，并绘制相关图标。
2 结果与分析 2.1 木糖标准曲线根据已知木糖标准品的浓度和高效液相对应木糖峰面积绘制标准曲线，可得木糖标准曲线线性回归方程Y=30838X+8292.9，(Y:木糖液相检测峰面积，X:木糖浓度)相关系数R2=0.999，在1~5 g/L内木糖质量浓度和峰面积有良好线性关系。如图 1所示，玉米苞叶木聚糖水解物主成分为木糖，且检测条件分离效果较理想。
|
| 图 1 玉米苞叶木聚糖水解液HPLC图谱 Fig. 1 HPLC chromatogram of corn bracts xylan hydrolyzate |
2.2 各因素对木聚糖提取率的影响 2.2.1 碱浓度对玉米苞叶木聚糖提取率的影响
由图 2可知，NaOH质量浓度达到8%时，木聚糖提取率(14.0%)最高，因而选择以8%的NaOH浓度作为后续试验优化条件。
|
| 图 2 碱浓度对玉米苞叶木聚糖提取率的影响 Fig. 2 Effect of NaOH concentration on extraction rate of xylan from corn bracts |
2.2.2 提取温度对玉米苞叶木聚糖提取率的影响
由图 3可知，在30~80℃，木聚糖提取率随提取温度的升高逐渐增加，80℃以后木聚糖提取率逐渐降低。其中80℃时木聚糖提取率(14.7%)最高，因而提取温度选择80℃作为后续试验优化条件。
|
| 图 3 温度对玉米苞叶木聚糖提取率的影响 Fig. 3 Effect of extraction temperature on extraction rate of xylan from corn bracts |
2.2.3 提取时间对玉米苞叶木聚糖提取率的影响
由图 4可知，随着提取时间的延长，木聚糖提取率先增加后减少，其中，6~18 h逐渐增加，18~48 h木聚糖提取率有小幅度降低，提取时间为18 h时，木聚糖提取率(15.3%)最高。
|
| 图 4 提取时间对玉米苞叶木聚糖提取率的影响 Fig. 4 Effect of extraction time on extraction rate of xylan from corn bracts |
2.3 响应面试验结果 2.3.1 试验结果及方差分析
响应面试验结果如表 2所示，通过Design-Expert 7.0数据分析软件进行回归分析，得到的模型方差分析结果如表 3所示。当Prob>F值小于0.05时，即表示该项指标显著。结果表明，对木聚糖提取率所建立的二项式模型具有高度显著性(P=0.000 4 < 0.01)。失拟项P=0.009 6 < 0.05显著；模型的调整确定系数R2=0.911 5，该模型能解释91.15%的响应值的变化，因该模型拟合程度比较好，试验误差小，可以用该模型对碱法提取玉米苞叶木聚糖进行分析和预测。
| 试验号 Test number |
A:氢氧化钠 A:NaOH(%) |
B:温度 B:Temperature(℃) |
C:时间 C:Time(h) |
木聚糖提取率 The yield of xylan (%) |
| 1 | 10 | 100 | 18 | 15.0 |
| 2 | 8 | 80 | 18 | 15.2 |
| 3 | 6 | 80 | 24 | 11.8 |
| 4 | 8 | 80 | 18 | 15.3 |
| 5 | 10 | 60 | 18 | 13.5 |
| 6 | 10 | 80 | 24 | 14.0 |
| 7 | 8 | 100 | 24 | 12.1 |
| 8 | 8 | 80 | 18 | 15.6 |
| 9 | 8 | 60 | 12 | 14.2 |
| 10 | 6 | 80 | 12 | 14.3 |
| 11 | 6 | 100 | 18 | 11.0 |
| 12 | 8 | 60 | 24 | 15.4 |
| 13 | 10 | 80 | 12 | 15.6 |
| 14 | 6 | 60 | 18 | 14.0 |
| 15 | 8 | 100 | 12 | 14.8 |
| 16 | 8 | 80 | 18 | 15.3 |
| 17 | 8 | 60 | 24 | 15.4 |
| 方差来源 Source of variance |
平方和 Sum of squares |
自由度F dF |
圴方和 Mean square |
F值 F value |
Prob>F |
| 回归模型 Regression model |
30.89 | 9 | 3.43 | 19.32 | 0.000 4 |
| 残差 Residual |
1.24 | 7 | 0.18 | ||
| 失拟项 Lack of fit |
1.15 | 3 | 0.38 | 17.10 | 0.009 6 |
| 纯误差 Pure error |
0.09 | 4 | 0.022 | ||
| 总误差 Total error |
32.14 | 16 |
由表 4可知，氢氧化钠浓度、提取温度、提取时间的一次项达到极显著水平(P < 0.01)，表明这3个因素对木聚糖提取率的线性效应极显著；对玉米苞叶木聚糖提取率的影响顺序：氢氧化钠浓度>提取时间>提取温度；二项A2和B2对木聚糖提取率的曲面效应显著(P < 0.01)，因素间交互作用影响：AB、BC极显著；Design-Expert 7.0数据分析软件回归分析，可得二次回归方程：
| 方差来源 Source |
平方和 Sum of squares |
自由度F dF |
圴方和 Mean square |
F值 F value |
Prob>F |
| A | 6.12 | 1 | 6.13 | 34.47 | 0.000 6 |
| B | 2.69 | 1 | 2.69 | 15.15 | 0.006 0 |
| C | 3.82 | 1 | 3.82 | 21.51 | 0.002 4 |
| AB | 5.06 | 1 | 5.06 | 28.49 | 0.001 1 |
| AC | 0.20 | 1 | 0.20 | 1.14 | 0.321 2 |
| BC | 5.08 | 1 | 5.08 | 28.56 | 0.001 1 |
| A2 | 5.22 | 1 | 5.22 | 29.36 | 0.001 0 |
| B2 | 3.02 | 1 | 3.02 | 17.01 | 0.004 4 |
| C2 | 0.38 | 1 | 0.38 | 2.15 | 0.185 9 |
| 注：R2= 0.961 3，调整R2=0.911 5 Note:R2= 0.961 3，revise R2=0.911 5 |
|||||
Y=-10.0625+2.33571A+0.24491B+0.7378C+0.028125AB+0.018750AC-8.69048×10-3BC-0.28036A2-2.13393×10-3 B2-8.43254×10-3 C2。
2.3.2 响应面分析通过模型方程所作的响应曲面图及其等高线如图 5~7所示，结果表明，碱浓度和提取温度交互作用最为显著(P < 0.01)，其次为温度和时间。
|
| 图 5 碱液浓度和提取温度对玉米苞叶木聚糖提取率的影响 Fig. 5 Effects of alkali concentration and extraction temperature on extraction rale of xylan from corn bracts |
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| 图 6 氢氧化钠浓度和提取时间对玉米苞叶木聚糖提取率的影响 Fig. 6 Effects of alkali concentration and extraction time on extraction rate of xylan from corn bracts |
|
| 图 7 提取温度和提取时间对玉米苞叶木聚糖提取率的影响 Fig. 7 Effects of extraction temperature and extraction time on extraction rate of xylan from corn bracts |
由图 5可知，氢氧化钠浓度为6%~8%，温度为60~80℃时，两者呈显著增效作用，木聚糖提取率随碱浓度的增加而增加；温度为80~100℃时，木聚糖提取率随碱浓度的增加而降低。由图 6可知，氢氧化钠浓度为6%~8%，时间为12~18 h时，两者呈显著增效作用，木聚糖提取率随碱浓度的增加而增加；氢氧化钠浓度为8%~10%，时间为18~24 h时，木聚糖提取率随碱浓度的增加反而开始降低。
通过软件分析，碱法提取玉米苞叶木聚糖的最佳条件：氢氧化钠浓度9.12%，提取温度92.48℃，提取时间12.61 h，此条件下木聚糖提取率为16.0%。
为检验RSM法的可靠性，采用上述最优提取条件进行玉米苞叶木聚糖的提取，同时考虑实际操作的情况，将木聚糖最佳提取条件修正为氢氧化钠浓度9.2%，提取温度为93℃，提取时间为13.0 h，在此条件下，进行3个平行试验，木聚糖平均提取率为(15.8±0.11)%，与理论预测值偏差1.25%，证明采用响应面法正交优化工艺是稳定的，具有可重复性。
3 结论本研究结果表明，碱法用于提取玉米苞叶中的木聚糖是可行的。氢氧化钠水溶液提取玉米苞叶木聚糖的优化工艺为氢氧化钠浓度9.2%、提取温度93℃、提取时间13.0 h，在该工艺条件下，木聚糖提取率为(15.8±0.11)%(n=3)。氢氧化钠浓度、提取温度、提取时间对木聚糖提取率的影响显著；氢氧化钠浓度和提取时间、提取温度和提取时间的交互项对木聚糖提取率的曲面效应显著。
本研究结果为解决玉米苞叶高深加工利用提供思路，为玉米苞叶高效制备木聚糖提供依据。
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