2. 南宁师范大学, 北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室, 广西南宁 530000
2. Key Laboratory of Environment Change and Resources Use in Beibu Gulf, Nanning Normal University, Nanning, Guangxi, 530000, China
近江牡蛎(Crassostrea rivularis)属于动物界(Animalia)、软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、翼形亚纲(Pteriomorphia)、牡蛎目(Osteroida)、牡蛎科(Ostreidae)，广温性潮间带底栖生物[1-2]。有研究表明，近江牡蛎热胁迫后，热休克蛋白90(Heat shock protein 90，Hsp90)的mRNA表达显著升高，可促进受损蛋白复性[3-4]，但目前还未见关于这一调控机制的相关研究报道。DNA甲基化作为一种表观遗传的重要形式，可以对内源及外界环境变化做出反应，因此，通过甲基化修饰(DNA甲基化和去甲基化)调控基因表达，被认为在生物适应性中扮演重要角色[5-6]。为揭示高温胁迫对近江牡蛎Hsp90 mRNA表达及核心启动子CpG甲基化的影响，本研究以近江牡蛎成贝为实验对象，明确Hsp90 mRNA在成贝中的组织分布，以及在高温胁迫条件下，Hsp90 mRNA组织表达、核心启动子CpG平均甲基化率、核心启动子各CpG位点甲基化率及与核心启动子RNA polymeraseⅡ结合等情况。该实验结果可丰富广温性潮间带底栖生物的温度调控机制研究。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物近江牡蛎(约2年龄)成贝样品采集于广西钦州湾茅尾海地区的两个养殖区(21°43′0″ N，108°35′8″ E和21°39′21″N，108°51′58″E)，养殖条件如下：温度31.5℃和31.7℃，盐度17.7‰和17.9‰，pH值分别为7.72和7.81，电导率分别为28.86 μs/cm和29.17 μs/cm，样品采集后放入采集箱中，立即送回实验室处理。
1.1.2 主要试剂RNAzol试剂，购自MRC公司；SYBR®Select Master Mix试剂盒，购自ABI公司；QIA quick Gel Extraction试剂盒，购自QIAGEN公司；rTaq E、10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP、DNA Marker 2000、基因组DNA提取试剂盒和克隆载体PMD19-T Vectors，购自TaKaRa公司；DH5α感受态细胞和X-gal，购自北京全式金公司；DNA MethylationTM kit，购自EZ Research公司；EZ ChIP assay kit，购自Millipore公司；引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.1.3 主要仪器电泳仪(型号为Powerpac HV 164-5056)，购自Bio-Rad公司；超微量紫外分光光度计(型号为NanoDrop-1000)，购自NanoDrop公司；全自动凝胶成像系统(型号为Syngene Genius)，购自Syngene公司；低温恒温槽(型号为DC-1006)，购自无锡沃信仪器有限公司；梯度热循环仪(型号为T100)，购自Bio-Rad公司；荧光定量PCR仪(型号为7500FAST)，购自ABI公司；高速离心机(型号为5810R)、离心机(型号为mini spin plus)，购自Eppendorf公司；紫外分光光度计(型号为Cary 50)，购自Varian公司；生物安全柜(型号为HF Safe 760S)，购自Heal Force公司；电热恒温鼓风干燥箱(型号为DHG-9070A)，购自上海精宏设备有限公司。
1.2 方法 1.2.1 近江牡蛎Hsp90核心启动子序列分析依据GenBank数据库中已登录的近江牡蛎Hsp90序列(登录号：HQ450642)，利用在线生物信息学软件和Meth Primer软件分析近江牡蛎Hsp90启动子序列并设计MSP引物。
1.2.2 近江牡蛎热胁迫1.1.1节实验动物采集后，成贝放入28℃、盐度18.0‰、pH值为7.70的水环境中驯养一周，每天换水一次(换水量约达总体积的一半)，上午和下午各投喂适量扁藻；驯养一周后，将实验组水温升高至40℃，其余条件保持不变，对照组所有条件均保持不变，热胁迫24 h；取实验组和对照组各12只成贝进行解剖，取其消化腺、腮、唇瓣、外套膜、肌肉柱和心脏组织于液氮速冻后－80℃保存，用于后续实验分析。
1.2.3 荧光定量PCR及数据分析运用RNAzol法提取1.2.2节中成贝消化腺、腮、唇瓣、外套膜、肌肉柱和心脏组织样品中的总RNA，取1.0 μg总RNA进行反转录制备cDNA模板。根据GenBank已登录序列设计Hsp90(登录号：HQ450642)和β-actin(登录号：AF026063)qPCR引物(表 1)，在7500 FAST real-time PCR检测系统(Applied Bio systems)进行荧光定量分析，以2－△△CT法计算结果。
| 引物名称 Primer name |
引物序列 Primer sequence (5′-3′) |
产物长度 Product length (bp) |
| Hsp90 qPCR | Forward：5′-AAAAGGCAGAGGCAGACAAA-3′ Reverse：5′-ACGGGTTCTTGTGTTTCTGG-3′ |
187 |
| β-actin qPCR | Forward：5′-CTGTGCTACGTTGCCCTGGACTT-3′ Reverse：5′-TGGGCACCTGAATCGCTCGTT-3′ |
129 |
| Hsp90 MSP | Forward：5′-TTTTCGTAAAAATTTATAGGAACGA-3′ Reverse：5′-TACATCAACCATTAATAAACCCGA-3′ |
149 |
| Hsp90 ChIP PCR | Forward：5′-TATCATTTTTCCCTCGTAAAA-3′ Reverse：5′-TCAATACACATCCCAAAATAG-3′ |
202 |
1.2.4 MSP及数据分析
运用TaKaRa基因组DNA提取试剂盒提取1.2.2节中成贝消化腺、腮、唇瓣、外套膜、肌肉柱和心脏组织的基因组DNA，再依据DNA MethylationTM kit试剂盒说明书将每个组织样品的0.5 μg基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，制备MSP模板。根据GenBank已登录序列设计Hsp90(登录号：HQ450642) MSP引物(表 1)。MSP实验中每个组织样品，平行测序一次，计算核心启动子CpG平均甲基化率(%)及各CpG位点甲基化率(%)。
1.2.5 染色质免疫共沉淀实验依据EZ ChIP assay kit试剂盒说明书进行：取1.2.2节中成贝消化腺、腮、唇瓣、外套膜、肌肉柱和心脏组织各0.1 g，在含有1 μg/mL蛋白酶抑制剂cocktail Ⅱ的400 μL PBS缓冲液中充分消化，消化后的组织加入1 mL SDS Lysis缓冲液裂解，运用微尖超声破碎仪将基因组破碎为0.2~0.8 kb长度的小片段，再将2 μg的特异性RNA聚合酶Ⅱ抗体加入破碎小片段中4℃过夜孵育，孵育结束后，以此为模板，根据GenBank已登录序列设计Hsp90(登录号：HQ450642) ChIP引物(表 1)，进行ChIP PCR实验，PCR产物进行3%琼脂糖凝胶检测及灰度分析。
2 结果与分析 2.1 近江牡蛎Hsp90核心启动子序列近江牡蛎Hsp90核心启动子含有1个CpG岛、1个HSE、1个TATA box元件，CpG岛含有7个CpG位点(图 1)，其中CpG1、CpG6和CpG7位于MSP引物中(图 1)，所研究的4个CpG位点从CpG2到CpG5位置信息为-125, -84, -74, -64(表 1)。
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| 图 1 近江牡蛎Hsp90核心启动子序列 Fig. 1 `The core promoter sequence of C.rivularis Hsp90 |
2.2 近江牡蛎Hsp90 mRNA表达及核心启动子CpG平均甲基化率
Hsp90基因在近江牡蛎消化腺、腮、唇瓣、外套膜、肌肉柱和心脏组织中均有表达(图 2a)；与对照组比较，热胁迫24 h后实验组消化腺、腮和心脏组织中Hsp90 mRNA表达升高，差异显著(P＜0.05)(图 2a)，Hsp90核心启动子CpG平均甲基化率降低，差异显著(P＜0.05)(图 2b)。
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| 图 2 热胁迫24 h前后Hsp90 mRNA相对表达及核心启动子平均甲基化率变化 Fig. 2 The Hsp90 mRNA expression and core promoter methylation levels of C.rivularis before and after treatment by high temperature stress for 24 h |
2.3 近江牡蛎Hsp90 mRNA核心启动子各CpG位点平均甲基化率
热胁迫后，与对照组比较，实验组腮组织的CpG2平均甲基化率显著降低(P＜0.05)(图 3a)；实验组消化腺组织和腮组织的CpG3平均甲基化率显著降低(P＜0.05)(图 3b)；实验组心脏组织的CpG4平均甲基化率显著降低(P＜0.05)(图 3c)，而较远距离的CpG5位点甲基化水平无显著变化(图 3d)。
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| 图 3 热胁迫前后Hsp90核心启动子CpG位点甲基化 Fig. 3 The Hsp90 CpGs methylation levels of C.rivularis before and after treatment by high temperature stress for 24 h |
2.4 染色质免疫共沉淀实验
热胁迫后，灰度分析显示，与对照组比较，实验组消化腺和心脏组织Hsp90核心启动子与RNA polymeraseⅡ结合增强，腮出现弱结合现象(图 4)。
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| 图 4 热胁迫前后Hsp90核心启动子与RNA polymeraseⅡ结合 Fig. 4 Binding status of RNA polymeraseⅡ to Hsp90 promoter in C.rivularis before and after treatment by high temperature stress for 24 h |
3 讨论
荧光定量PCR结果显示：在非胁迫状态下，Hsp90 mRNA在近江牡蛎消化腺、腮、唇瓣、外套膜、肌肉柱和心脏组织中均有表达；热胁迫(40℃，24 h)后，与对照组比较，实验组消化腺、腮和心脏组织中Hsp90 mRNA相对表达都出现了显著性升高(图 2a)，这一结果与陈晨[3]在近江牡蛎中的热胁迫实验结果一致，也与Farcy等[7]在欧洲鲍螺(Haliotis tuberculata)中所得结果较一致，表明Hsp90 mRNA在短时间内极显著增加，是热胁迫中的机体应激调节现象，高热产生的Hsp90可增强细胞对下一次损伤的耐受，维持细胞的正常代谢，提高生存率[8]，但是这仅仅是几种特例还是普遍现象，需在多种物种中做进一步研究。
根据GenBank已登录近江牡蛎Hsp90序列(登录号：HQ450642)，分析其5′端调控区的核心启动子，其含有1个CpG岛(－164~－16)，1个HSE、1个TATA box(图 1)。利用亚硫酸氢盐处理基因组DNA结合MSP法，比较热胁迫前后Hsp90核心启动子CpG平均甲基化率，结果显示：与对照组比较，实验组消化腺、腮和心脏组织中核心启动子区CpG平均甲基化率降低，差异显著(P＜0.05)(图 2b)，表明甲基化可能参与调控Hsp90在热胁迫后的基因表达，从而提高近江牡蛎对热胁迫环境的适应性。以往在植物中的研究已经证明，拟南芥(Arabidopsis thaliana)[9]、玉米(Zea mays)[10]、蒲公英(Taraxacum mongolicum)[11]和水稻(Oryza glaberrima)[12]均可因被环境条件所胁迫从而修饰基因组DNA甲基化水平，调控环境胁迫下的基因表达，提高植物对环境的适应性[13-16]。与植物相比，在水产动物皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)的研究中也显示，在环境因子胁迫下，基因组DAN甲基化模式的改变可启动胁迫响应机制，通过调控相关抗逆基因的表达，促使表型性状发生变异，增强皱纹盘鲍对不良环境的适应能力[17]。
比较热胁迫前后Hsp90核心启动子各CpG位点平均甲基化率，与对照组比较，实验组腮组织的CpG2平均甲基化率显著降低；实验组消化腺组织和腮组织的CpG3平均甲基化率显著降低；实验组心脏组织的CpG4平均甲基化率显著降低；而较远距离的CpG5位点甲基化水平无显著变化。HSE是位于Hsp90基因5′端上游的一段特殊重复排列序列，热休克时，HSE可增加对热休克因子(Heat shock factor，HSF)的结合，是Hsp90热休克反应中的重要元件[18]，推测去甲基的发生可降低HSE与HSF结合的空间位阻，从而更有利于Hsp90转录发生。
染色质免疫共沉淀实验结果显示，热胁迫后，与对照组比较，实验组消化腺和心脏组织Hsp90核心启动子与RNA polymeraseⅡ结合显著增强，而腮也出现弱结合现象(图 4)。这一实验结果证实了MSP实验的结果，邻近HSE的CpG2、CpG3和CpG4位点甲基化水平显著降低，可提高Hsp90核心启动子与RNA polymeraseⅡ结合强度，从而增加在热胁迫后Hsp90 mRNA表达。
4 结论Hsp90是近江牡蛎抵御高温胁迫的主要表达基因，核心启动子甲基化模式参与调控Hsp90在热胁迫后的mRNA表达，从而提高近江牡蛎对热胁迫环境的适应性。
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