黑老虎(Kadsura coccinea)是五味子科南五味子属藤本植物，别名冷饭团、过山龙藤，生于江西、福建、湖南、广东、广西、四川、贵州、云南等地。黑老虎茎、叶一年四季青绿，可用于绿廊、凉亭等园林配置[1]。其果型为聚合果，果大有光泽，表面纹理像菠萝，垂吊如灯笼，具有较高的观赏价值。黑老虎根可入药，活血行气，消肿止痛，治疗胃病，亦常用于妇科[2]。目前，市场上对黑老虎的关注度越来越高，而野生资源的过度采挖，致使黑老虎种群生存情况不容乐观[3]。国内外关于黑老虎化学成分、药理作用、挥发油成分、栽培技术的研究较多[4-13]，但有关其遗传多样性的研究并不多见。为准确揭示黑老虎遗传多样性，急需建立其特定的多样性检测体系。ISSR是一种建立在PCR技术基础上的DNA分子标记，具有操作方便、低成本、遗传多态性高等特点，已广泛应用于种质资源鉴定、遗传多样性分析等研究领域[14-18]。每一个物种的ISSR-PCR反应体系最适宜的条件不同，黑老虎的最适宜条件需进一步摸索。本文运用正交设计及单因素试验相结合的方法，对Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、DNA模板用量、扩增程序中退火温度及循环次数等黑老虎ISSR-PCR反应体系的关键参数进行系统研究，以期建立并优化黑老虎的ISSR-PCR反应体系，为其遗传多样性评价等深入研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料试验材料于2018年9月采自广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所种质资源圃，采集生长良好、色泽亮丽、健康无虫害的新鲜叶片2—3片，保存于冰盒带回实验室后用液氮冷冻。样品经广西植物研究所漆小雪研究员鉴定为黑老虎(Kadsura coccinea)叶片。
1.2 仪器及药品药品试剂：ISSR引物、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、DNA Marker S、琼脂糖，以上试剂都购于卓一生物技术有限公司。
实验仪器：PCR仪(美国BIO-RAD伯乐公司), DYCP-34型电泳槽(北京市六一仪器厂), TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司), 离心机(珠海黑马医学仪器有限公司), UVP凝胶成像系统, CDYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂), －20℃冰箱, －4℃冰箱。
1.3 方法 1.3.1 黑老虎植物基因组DNA的提取采用CTAB法对黑老虎植物基因组DNA进行提取。用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检验所提取基因组DNA的质量和完整性，用紫外分光光度计检测基因组DNA的纯度和浓度。
1.3.2 ISSR-PCR反应体系正交试验不同的物种有各自最佳的ISSR反应体系，要建立一个适于黑老虎的ISSR反应体系需要先对该体系进行优化。运用正交方案进行初步的筛选，随后利用单因素设计针对性地统一优化，优化的内容包括Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、DNA模板用量、PCR扩增循环次数、退火温度等。
采用正交设计试验确定每个因素中扩增效果最好的条件。正交试验主要包括设计Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶、DNA、dNTPs这5个试验因素的梯度差。每一个因素都设计4个浓度梯度差，如表 1、表 2所示。为避免偶然性发生，每个浓度设置3个重复。除此之外，这4个浓度梯度系列中，每个体系都加入2.5 μL 10× PCR Buffer，最后用灭菌后的ddH2O补足至20 μL。本次选用的引物为866(序列为5′-CTC CTC CTC CTC CTC CTC-3′)。退火温度为54℃。
| 水平 Levels |
因素 Factors |
||||
| Mg2+ (mmol/L) |
dNTPs (mmol/L) |
引物 Primer (μmol/L) |
Tap DNA聚合酶 Tap DNA polymerase (U) |
DNA (ng) |
|
| 1 | 1.0 | 0.1 | 0.2 | 0.5 | 10 |
| 2 | 1.5 | 0.2 | 0.4 | 1.0 | 30 |
| 3 | 2.0 | 0.4 | 0.6 | 1.5 | 50 |
| 4 | 2.5 | 0.5 | 0.8 | 2.0 | 70 |
| 编号 Number |
因素 Factors |
||||
| Mg2+ (mmol/L) |
dNTPs (mmol/L) |
引物 Primer (μmol/L) |
Tap DNA聚合酶 Tap DNA polymerase (U) |
DNA (ng) |
|
| 1 | 1.0 | 0.1 | 0.2 | 0.5 | 10 |
| 2 | 1.5 | 0.1 | 0.4 | 1.0 | 30 |
| 3 | 2.0 | 0.1 | 0.6 | 1.5 | 50 |
| 4 | 2.5 | 0.1 | 0.8 | 2.0 | 70 |
| 5 | 1.5 | 0.2 | 0.2 | 1.5 | 70 |
| 6 | 1.0 | 0.2 | 0.4 | 2.0 | 50 |
| 7 | 2.5 | 0.2 | 0.6 | 0.5 | 30 |
| 8 | 2.0 | 0.2 | 0.8 | 1.0 | 10 |
| 9 | 2.0 | 0.4 | 0.2 | 2.0 | 30 |
| 10 | 2.5 | 0.4 | 0.4 | 1.5 | 10 |
| 11 | 1.0 | 0.4 | 0.6 | 1.0 | 70 |
| 12 | 1.5 | 0.4 | 0.8 | 0.5 | 50 |
| 13 | 2.5 | 0.5 | 0.2 | 1.0 | 50 |
| 14 | 2.0 | 0.5 | 0.4 | 0.5 | 70 |
| 15 | 1.5 | 0.5 | 0.6 | 2.0 | 10 |
| 16 | 1.0 | 0.5 | 0.8 | 1.5 | 30 |
PCR扩增程序：在94℃条件下预变性5 min，94℃条件下变性30 s，54℃条件下退火50 s，72℃条件下延伸5 min，4℃保存。扩展结束后将PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳1.0—1.5 h，用溴化乙啶染色20—25 min，随后采用UVP凝胶电泳成像系统拍照备注保存。
1.3.3 ISSR-PCR反应单因素试验设计在正交试验基础上进行单因素试验。每个因素设计的水平如下：Mg2+浓度为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol/L；dNTPs浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L；引物浓度为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol/L；Taq DNA聚合酶用量为0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 U；DNA模板用量为15，30，45，60，75，90 ng。
1.3.4 ISSR-PCR反应程序的优化根据正交试验及单因素试验结果，进一步确定反应体系后，继续对退火温度以及循环次数进行优化。退火温度设置为(Tm±5)℃，如(51±5)℃，那么PCR仪自动形成12个温度梯度：46.0，46.3，47.0，48.0，49.2，50.4，51.6，52.8，54.0，55.0，55.7，56.0℃。循环次数设置为25，30，35，40，45，50次。以上处理重复2次，避免偶然性存在。
1.3.5 ISSR反应体系的验证从黑老虎提取的DNA中随机选取2个样品，用前期试验确定的反应体系对样品进行扩增，以此检验扩增效果的稳定性。利用正交试验以及单因素试验确定的ISSR-PCR反应体系对引物进行筛选，从黑老虎的DNA样品中随机选择出2个样品作为ISSR-PCR反应体系的模板，对100条引物进行PCR扩增，从扩增效果好的条带中，选择出条带明亮、清晰、重复性好的引物进行ISSR分析。
2 结果与分析 2.1 ISSR反应体系正交试验结果由ISSR-PCR正交试验结果(图 1)可知，组合3，14，15部分重复没有条带出现，这些组合扩增效果最差。组合1，2，4，7，8，9，12，16有条带，但是条带不明显，模糊不清，很难辨别。组合5，6，10，11，13具有清晰明亮的条带，组合5的条带最具有层次性，清晰可辨，且3次重复具有正态性，因此选择该组合作为单因素试验点样的基础。
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| 1—16分别对应正交试验组合1—16 1—16 correspond to orthogonal test combinations 1-16 respectively 图 1 ISSR-PCR正交试验扩增结果 Fig. 1 Amplification results of ISSR-PCR orthogonal test |
2.2 Mg2+浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响
由图 2可以看出，Mg2+浓度低时ISSR-PCR扩增效果较差，条带模糊不清晰或缺失。随着Mg2+浓度的加大，条带越来越清晰；当浓度为2.5 mmol/L时，条带较为清晰，亮度最高。因此，选择Mg2+浓度为2.5 mmol/L作为下一步研究的条件。
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| 1—6对应的Mg2+浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol/L 1—6 correspond to Mg2+ concentration of 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 mmol/L 图 2 Mg2+浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响 Fig. 2 Effect of Mg2+ concentration on ISSR-PCR amplification |
2.3 dNTPs浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响
dNTPs对ISSR-PCR的影响如图 3所示。在20 μL体系中，dNTPs浓度为0.10 mmol/L时，条带最清晰；提高dNTPs浓度，扩增条带清晰度呈现下降趋势。因此，选择dNTPs浓度为0.10 mmol/L作为下一步试验的条件。
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| 1—6表示dNTPs浓度分别为0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 mmol/L 1—6 represents dNTPs concentration of 0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50, 0.60 mmol/L 图 3 dNTPs浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响 Fig. 3 Effect of dNTPs concentration on ISSR-PCR amplification |
2.4 引物浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响
不同的引物浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响如图 4所示，引物浓度为0.6 μmol/L时最适合ISSR-PCR反应体系的扩增。其余条带的情况则表明，在20 μL体系时，其他的引物浓度不利于黑老虎的PCR扩增。故选择引物浓度为0.6 μmol/L进行下一步试验。
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| 1—6表示引物浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol/L 1—6 represents primer concentration of 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 μmol/L 图 4 引物浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响 Fig. 4 Effect of primer concentration on ISSR-PCR amplification |
2.5 Taq DNA聚合酶用量对ISSR-PCR扩增效果的影响
Taq DNA聚合酶的用量会影响扩增产物，用量多则成本高，且容易扩增出非特异性产物，但用量少又会导致产物合成的效率低[16]。如图 5所示，在20 μL体系里，Taq DNA聚合酶用量为0.25—1.00 U时，几乎没有产物出现；Taq DNA聚合酶用量为1.50 U时(编号4)，条带清晰、亮度高，故选择1.50 U作为下一步试验的Taq DNA聚合酶用量。
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| 1—6表示Taq DNA酶用量分别为0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 U 1—6 represents Taq DNA polymerase dosage of 0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50 U 图 5 TaqDNA聚合酶用量对ISSR-PCR扩增效果的影响 Fig. 5 Effect of Taq DNA polymerase dosage on ISSR-PCR amplification |
2.6 模板DNA用量对ISSR-PCR扩增效果的影响
如图 6所示，编号1，2，5，6产物所扩增的条带不够清晰明亮，背景模糊不清，表明生成的产物较少，因此模板DNA用量为15，30，75，90 ng时，ISSR-PCR扩增效果差。编号3的产物条带明亮清晰，故选择45 ng模板DNA用量进行下一步的试验。
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| 1—6表示模板DNA用量分别为15，30，45，60，75，90 ng 1—6 represents template DNA dosage of 15, 30, 45, 60, 75, 90 ng 图 6 模板DNA用量对ISSR-PCR扩增效果的影响 Fig. 6 Effect of template DNA dosage on ISSR-PCR amplification |
2.7 退火温度对ISSR-PCR扩增效果的影响
退火温度对ISSR-PCR扩增效果的影响如图 7所示，部分组合没有条带产生，表明该退火温度不适合黑老虎ISSR-PCR的扩增。退火温度在50.4℃时，条带的强度高，清晰明亮，副带也清晰，因此该引物的最佳退火温度确定为50.4℃，其他引物的退火温度也采用同样的退火温度梯度进行筛选。
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| 1—12代表退火温度分别为46.0，46.3，47.0，48.0，49.2，50.4，51.6，52.8，54.0，55.0，55.7，56.0℃ 1—12 represents annealing temperature of 46.0, 46.3, 47.0, 48.0, 49.2, 50.4, 51.6, 52.8, 54.0, 55.0, 55.7, 56.0℃ 图 7 退火温度对ISSR-PCR扩增效果的影响 Fig. 7 Effect of annealing temperature on ISSR-PCR amplification |
2.8 循环次数对ISSR-PCR扩增效果的影响
循环次数对ISSR-PCR扩增效果的影响如图 8所示，一共有6个循环组合，每个循环组合设立了6次重复试验。循环次数为25，30次时没有条带出现，表明该循环次数扩增效果不佳。循环次数为35，45，50次时有些许的条带出现，但条带模糊不清晰，强度弱，层次不分明，扩增产物较少，故不选择。循环次数为40次时，扩增产物较多，条带清晰，层次分明，强度高，条带的数目也明显更多。故而40次为最佳循环次数。
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| 1—6表示循环次数为20，25，30，35，40，45次 1—6 represents cycle times of 20, 25, 30, 35, 40, 45 图 8 循环次数对ISSR-PCR扩增效果的影响 Fig. 8 Effect of cycle times on ISSR-PCR amplification |
3 讨论
单独采用单因素试验仅考虑单个因素不同水平对试验结果的影响，忽视了各个因素之间的相互作用，在优化试验组合时，会一定程度上降低最佳反应水平的可靠程度[19-20]。正交试验设计考虑多个因素水平的相互作用，利用最少的组合数考察因素和水平对结果的影响程度，得出最佳组合。本试验先用正交试验进行初步筛选，再通过单因素试验进行优化，极大地减少了试验次数和时间，快速建立黑老虎的ISSR-PCR反应体系。试验结果显示，黑老虎ISSR-PCR反应体系对Mg2+浓度要求严格，浓度过低时无法扩增出条带。这可能是由于反应体系中其他因素对Mg2+较为敏感，如Mg2+是Taq DNA聚合酶的必需激活剂，体系中Mg2+浓度过高，会出现Taq DNA聚合酶扩增出的特异性产物浓度降低，浓度过低会降低酶的效率。Mg2+可与其他因素结合，最终影响PCR扩增的效率和特异性。由以上的正交试验和单因素试验结果可知，在20 μL ISSR-PCR反应体系中，黑老虎的最佳反应条件为Mg2+浓度为2.5 mmol/L、dNTPs浓度为0.1 mmol/L、引物浓度为0.6 μmol/L、Taq DNA聚合酶用量为1.50 U、模板DNA用量为45 ng。扩增程序为在94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50.4℃退火30 s，72℃延伸30 s，以上3个步骤循环40次；最后72℃延伸10 min。本试验首次研究建立黑老虎ISSR-PCR反应体系，并获得稳定可靠结果，可以适应于其他黑老虎品种，为今后黑老虎遗传多样性和遗传结构研究奠定基础。
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