0 引言

非那雄胺为合成的甾体激素化合物，化学名为N-叔丁基-3-羰基-4-氮杂-5α-雄甾-1-烯-17β-酰胺，分子式为C₂₃H₃₆N₂O₂^[1]。其制剂最早由美国默沙东公司于1991年开发研制，国内首仿成功的是天方药业公司^[2]。非那雄胺是Ⅱ型5α-还原酶特异性抑制剂，在人体内通过阻碍睾酮转化为双氢睾酮，抑制睾酮代谢，可抑制前列腺增生，也可减轻雄激素对脱发的影响；其制剂规格为5 mg用于治疗和控制良性前列腺增生及相关症状，规格为1 mg用于治疗雄性激素源性脱发^[3-7]。非那雄胺合成工艺一般以3-羰基-4-雄甾烯-17β-羧酸为起始原料，经过酰胺化、氧化、还原等反应得到目标产物非那雄胺^[8]。在其合成过程中，各种反应不可避免使用重金属元素作为催化剂、还原剂或者氧化剂等，起始原料和使用的各种容器也会引入重金属元素。

药品重金属元素的存在，对人体健康具有潜在危害，这也是公众关心的问题^[9-12]。重金属进入人体后，很难被生物降解，会不断地积蓄，与体内相关的酶及蛋白质发生相互作用，由量变达到质变，影响人体正常生理机能、干扰新陈代谢。基于重金属元素的毒性划分，第一类重金属元素对人体有毒，包括As、Cd、Hg、Pb 4种；Se和Pd属于第二类，在原料药生产中添加时需要进行风险评估^[13]。当前国内外普遍采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)作为分析元素的工具，它能同时测定多种元素，且线性范围广，抗干扰能力强，灵敏度较高，分析速度快，是同时测定多种元素的首选方法^[14-18]。按《中华人民共和国药典》2015版二部的标准，非那雄胺需进行硒、砷盐、重金属总量检查^[1]，实验操作采用的是化学反应比色法，定性进行比较。为了定量考察非那雄胺原料药中有毒有害元素，同时测定其生产工艺中所使用的催化剂残留量，进一步完善质量标准，保障用药安全性，本研究建立ICP-MS法同时测定其中7种元素含量，并进行方法学验证。

1 材料与方法 1.1 材料

NexION 350电感耦合等离子体质谱仪(美国PE公司)；MARS6微波消解仪(美国CEM公司)，配恒温加热板；XS205DU电子分析天平(METTLER公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

镉(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、铅(Pb)、铬(Cr)单元素标准溶液浓度均为1 000 μg/mL，均为中国计量科学研究院产品，批号分别为GBW08612/17022，GBW(E)08611/15105，GBW08612/17022，GBW08619/16063，GBW08614/14113。钯(Pd)单元素标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心，批号GSB04-1745-2004，唯一标识191066，浓度1 000 μg/mL)；硒(Se)单元素标准溶液(坛墨质检-标准物质中心，批号B1904055/CW：G-158，浓度1 000 μg/mL)；Internal Standard Mix(Agilent Technologies，Part#5183-4681，Sc、Ge、In、Bi、Tb、Y、Li⁶，浓度10 μg/mL)；硝酸、过氧化氢为优级纯。非那雄胺原料药样品总共22批，分别由国内22个制剂生产厂家(编号1—22号)提供，均来源于两家原料药生产厂家。

1.2 方法 1.2.1 ICP-MS条件

仪器点火稳定后，用调谐液对仪器质量轴、氧化物、双电荷、灵敏度和分辨率等进行优化。根据待测元素特性，采用两种工作模式，Se采用标准模式，其他元素采用氦气碰撞模式。仪器参数设置：射频功率为1 550 W，氦气流量为4.3 mL/min，等离子体气流量为16.0 L/min，雾化气流量为1.0 L/min，辅助气流量为1.0 L/min，样品提升速率为1.0 mL/min，停留时间和积分时间均为50 ms，样品扫描次数20次，重复次数3次。各元素分析参数见表 1。

1.2.2 标准溶液制备

精密量取7种元素标准溶液适量，用5%(V:V)硝酸溶液逐级稀释，得到As、Cd、Cr、Pb、Pd、Se浓度为0，1，2，4，8，16，20 ng/mL；Hg浓度为0.0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 ng/mL，共7个浓度级别的7种元素混合标准曲线系列。

精密量取混合内标母液2 mL置于50 mL容量瓶中，用5%(V:V)的硝酸溶液稀释至刻度，摇匀得到Sc、Ge、In、Bi、Tb、Y、Li⁶浓度为400 ng/mL的混合内标溶液。

1.2.3 样品溶液制备

精密称取样品0.5 g置于微波消解罐中，加入6 mL浓硝酸，置于加热板上90℃加热40 min，挥发大部分气体。取下冷却后加入1 mL浓硝酸和1 mL过氧化氢，安装好消解罐，按照升温程序消解样品：10 min升到135℃，保持5 min，1 500 W；10 min升到150℃，1 500 W；25 min升到190℃，保持30 min，1 500 W。消解完毕冷却后打开消解罐，于加热板上90℃赶酸气30 min，冷却后将消解液转移至50 mL容量瓶中，并用超纯水多次清洗消解罐与盖子，洗液并入容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀即得。同时做样品空白试验。

2 结果与分析 2.1 线性关系考察

采用全定量分析模式，依次测定1.2.2节的标准曲线、1.2.3节样品空白溶液和样品溶液，同时以三通管的形式在线加入1.2.2节的混合内标溶液，按1.2.1节ICP-MS条件进行测定，以待测定元素与内标(以Sc为内标测定Cr，以Ge为内标测定As、Se，以In为内标测定Cd、Pd，以Bi为内标测定Hg、Pb)响应值的比值为纵坐标，各待测元素质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，由此计算待测样品质量浓度。线性方程与线性范围见表 2。

2.2 检出限与定量限考察

由仪器测定曲线得到仪器检出限(DL)，即连续11次测定标准空白仪器响应值标准偏差的3倍；定量限则是连续11次测定标准空白仪器响应值标准偏差的10倍，再根据实际取样量和稀释倍数计算方法检出限、定量限(表 2)。

2.3 精密度试验

取1.2.2节的配制的混合标准溶液(Hg浓度为1.6 ng/mL，其余元素浓度为16 ng/mL)适量，按1.2.1节ICP-MS条件进样测定6次，记录仪器响应值。结果As、Cd、Cr、Hg、Pb、Pd、Se仪器响应值的RSD分别为3.0%、2.4%、2.5%、1.2%、2.2%、3.2%、2.3%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

取1.2.2节配制的混合标准溶液(Hg浓度为1.6 ng/mL，其余元素浓度为16 ng/mL)适量，于室温下放置0，2，4，8，16，24 h时，按1.2.1节的ICP-MS条件进样测定，记录仪器响应值。结果As、Cd、Cr、Hg、Pb、Pd、Se仪器响应值的RSD分别为3.3%、3.0%、2.8%、1.8%、2.4%、3.4%、2.5% (n=6)，表明各个元素标准溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.5 重复性试验

精密称取1号厂家提供的样品0.5 g，共6份，分别置于微波消解罐中，精密加入加样回收试验中质量浓度的混合标准溶液，按1.2.3节方法制备样品溶液，再按1.2.1节ICP-MS条件进样测定，记录仪器响应值。结果As、Cd、Cr、Hg、Pb、Pd、Se仪器响应值的RSD分别为3.9%、3.1%、2.5%、2.2%、2.6%、3.8%、2.7%(n=6)，表明样品重复性良好。

2.6 加样回收试验

精密称取已知含量的样品(1号厂家提供)0.5 g，共9份，分别置于微波消解罐中，精密加入低、中、高质量浓度的混合标准溶液，按1.2.3节方法制备回收样品溶液，再按1.2.1节ICP-MS条件进样测定，记录仪器响应值并计算加样回收率，结果见表 3。表 3中样品含量为0.5 g样品中含有的各元素的量。As回收率偏高(超过100%)可能是因为样品基质对仪器测定有影响(Ar⁴⁰Cl³⁵)。

2.7 样品元素测定

取国内22个非那雄胺制剂生产企业提供的非那雄胺原料药，按1.2.3节方法制备供试品溶液，再按1.2.1节ICP-MS条件进样测定，平行测定3次，记录仪器响应值并按标准曲线法计算样品中7种元素的含量，结果见表 4。

2.8 样品元素测定结果分析

22批样品测定结果显示，Se均未检出，As、Cd、Hg分别只有4，2，1批检出，但其含量均较低，接近相应的检出限；Pd有17批检出，其含量为1.05—1.94 μg/kg，稍微大于其检出限1 μg/kg；Cr有8批检出，其含量为8.78—224.88 μg/kg；Pb有20批检出，其含量为22.56—1 394.74 μg/kg，是所有元素中含量最高的。Pb进入人体会后很难排出，会不断蓄积，达到一定浓度会对人体的脑部细胞有损伤，而且会干扰代谢活动，降低人体免疫力^[19]，因此在合成非那雄胺原料药时还应控制好铅含量，尽量降低其含量。非那雄胺收载于《中华人民共和国药典》2015年二部^[1]，其检查项目中规定，重金属总量不得超过10 μg/g、砷盐含量不得超过4 μg/g、硒含量不得超过50 μg/g，本研究22批样品均在限度规定范围内。国际人用药品注册技术协调会(ICH)发布的指导原则“Q3D”规定口服药品制剂中元素每日最大暴露量(PDE)^[20]，参考该限值并按照非那雄胺片(胶囊)说明书中成人每日口服药剂量为5 mg，使用表 3中各元素含量最大值计算出每日摄入量，详见表 5。22批样品各元素每日摄入量均远低于PDE，表明非那雄胺原料药中这些元素含量控制较好，总体风险较小。

3 讨论 3.1 元素Se同位素与测定模式的选择

选择同位素时，以优先选择最高丰度值为原则，但是要避免同量异位素重叠和多原子干扰。Se具有6个可检测到的稳定同位素，分别是⁷⁴Se、⁷⁶Se、⁷⁷Se、⁷⁸Se、⁸⁰Se、⁸²Se^[21]，虽然⁷⁸Se与⁸⁰Se丰度较高，但是在测定时会受到多原子⁴⁰Ar³⁸Ar⁺、³⁸Ar⁴⁰Ca⁺、⁴⁰Ar⁴⁰Ar⁺等形成的质谱干扰^[22]，⁷⁶Se也受³⁸Ar³⁸Ar⁺的干扰，而⁷⁴Se是因为丰度太低不适合采用；⁸²Se受到⁸²Kr的干扰^[23]。虽然可利用干扰方程消除影响，但是内标校正还是比较差，所作回归曲线不理想，故选择⁷⁷Se进行测定。碰撞模式就是将氦气通入碰撞池内，通过碰撞改变动能达到消除干扰物质的作用，但仪器灵敏度会降低；标准模式即单纯使用氩气进行测定。由于⁷⁷Se原本丰度值就比较低，所用⁷⁷Se最好使用标准模式进行测定。本研究所用仪器可以用氦气碰撞模式与标准模式同时测定，所以除Se外的元素均用氦气碰撞模式进行测定。

3.2 消解体系的选择

非那雄胺为白色结晶性粉末，是一种甾体化合物，纯度比较高，无其他难消解的化合物，因此首选硝酸作为消解溶剂。本课题前期考察了使用6，7，8，9，10 mL的硝酸及硝酸与1，2 mL过氧化氢对样品的消解效果，由于样品是粉末状，产生烟气比较多，单使用硝酸需要9 mL以上才能消解完全。本次实验采用是小型消解罐，不能加10 mL以上的硝酸，否则会有爆罐的风险，因此考虑加过氧化氢增强氧化性，减少硝酸使用量。通过试验选用消解体系为7 mL硝酸和1 mL过氧化氢。

3.3 生产工艺的改变

通过查阅文献可知，非那雄胺以前的合成工艺中脱氢反应步骤使用的是苯亚硒酸酐^[8]，因此《中华人民共和国药典》2015年二部^[1]收载的非那雄胺需要进行硒检查。随着经济的发展，响应保护环境的号召，毒性较大的苯亚硒酸酐被DDQ/BSTFA等试剂代替；而加氢步骤则使用钯碳作为催化剂，这与表 4中的Se均未检出、Pd大部分有检出的检测结果相符。由表 4中可知，Pd含量比较小，表明在合成工艺中钯碳催化剂的使用控制得比较好，没有在非那雄胺中较多地残留。在调研时非那雄胺生产企业也反馈了此信息，希望检验标准中能删除硒检查项，增加钯检查项。为了能较好地监控非那雄胺原料药的质量，完善质量标准，希望制定药品质量标准的相关部门能尽快着手，保障用药安全性。

4 结论

综上，采用ICP-MS测定非那雄胺中7种元素含量，方法简便、快速，精密度及稳定性好，灵敏度高，为其质量控制及完善质量标准提供了实验基础。