血瘀证是由瘀血内阻引起的病症，是中医证候研究领域的热点^[1]。现代医学认为，血瘀证主要表现在血流动力学、血液流变学、血栓、微循环障碍、血管内皮损伤、炎症等方面，会导致各组织器官水肿、炎症渗出、血栓形成、组织变性、结缔组织增生等病理变化，是临床上常见的证候之一^[2-4]。有研究表明，蒲黄(Pollen typhae)对血瘀证具有比较明确的治疗作用，如孔祥鹏等^[5]通过对血瘀模型大鼠的研究，认为蒲黄可改变异常的血液流变学，降低纤维蛋白原含量从而起到化瘀的作用；刘鹏和周军^[6]认为蒲黄可以改变局部血液循环，促进血管及纤维组织增生；杨梓超等^[7]研究发现, 蒲黄提取物可以下调糖尿病视网膜病变中的炎症水平；过鑫昌等^[8]通过临床双盲实验研究证实蒲黄能影响血脂，降低血清总胆固醇含量，降低血小板黏附率，从而影响血小板功能，对血管内皮细胞具有修复作用并抑制粥样斑块的形成。目前，作为活血化瘀药，蒲黄对血液流变学指标有改善作用^[9]，且可改善糖尿病大鼠血液中炎症因子的水平^[10]，对急性血瘀大鼠的药代动力学作用明显^[11]，但其发挥治疗作用的可能药效物质基础及作用机制尚不明确。

蒲黄主要含有黄酮类、甾体、有机酸、烷烃、挥发油、多糖等化学物质^[12]，具有止血、化瘀、通淋等功效。蒲黄总黄酮可显著改善急性血瘀证家兔的血液流变学，并抑制血小板聚集^[13]；Wang等^[14]研究表明，蒲黄总黄酮是活血化瘀的主要活性成分。蒲黄黄酮类成分槲皮素、异鼠李素、柚皮素等均可抑制血小板聚集^[15-17]；花生四烯酸在体内被迅速代谢，其代谢物参与细胞免疫及炎症反应^[18]；山奈酚可抑制炎症因子，具有抗炎作用^[19]。上述研究成果揭示以上化合物可能是治疗血瘀证的主要活性成分。

网络药理学(Network pharmacology)基于在线的数据库、平台和作图软件等，依据中药多成分、多靶点、多途径的整体研究思路，通过数据挖掘、分析以及数据可视化等阐明药物的分子作用机制网络。前期本实验课题组采用LC-MS方法对蒲黄中的主要化学成分进行定量分析^[20]，本实验基于整体观，在前期研究基础上采用网络药理学方法，筛选蒲黄活性成分及其作用靶点、通路，保留与血瘀证相关的靶点，并与阳性药阿司匹林分子对接强度比较，以此探讨其治疗血瘀证的分子作用机制。

通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)搜索蒲黄全部的化学成分，以口服利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug-Likeness，DL)≥0.18两个ADME (药物在体内的吸收Absorption、分布Distribution、代谢Metabolism、排泄Excretion过程)参数为筛选条件，初步筛选出蒲黄活性成分及其作用靶点，并根据潘祥龙等^[2]的研究成果补充蒲黄中具有活血化瘀功效的化合物。经文献筛选补充的化合物在TCMSP数据库进行检索匹配，若TCMSP未收载，则利用Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载化合物分子的3D结构并导入Swiss TargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测活性成分的作用靶点。对获得的蛋白质靶点统一使用Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)进行规范。

将1.1节初步筛选出的作用靶点输入PharmGKB数据库(https:/org//www.Pharmgk-b)、TTD数据库(http://db.i drblab.net/ttd/)、CTD数据库(http://ctdb ase.org/)，筛选出蒲黄活性成分的作用靶点，保留与血瘀证相关的靶点，舍去非相关靶点。

运用Cytoscape3.8.2对结果进行可视化，构建蒲黄成分-靶点图，用“节点(node)”表示成分或靶点或通路，用“边(edge)”表示节点之间的关系。利用Cytoscape3.8.2软件内置工具(network analyzer)分析网络拓扑结构，以连接度(Degree)、介度(Betweenness Centrality)与紧密度(Closeness Centrality)的数值为主要参考，识别活性成分、作用靶点和通路。

为明晰靶点间的相互作用，将1.2节筛选出的蒲黄活性成分作用靶点提交到STRING11.0数据库(https://string-db.org/)，以“Homo sapiens”为筛选条件，构建蛋白质相互作用(PPI)网络，设定阈值“highest confidence”>0.9，其余条件均为默认。利用Metascape平台(https://metascape.org/gp/index.html)挖掘PPI网络中潜在的功能模块，并对功能模块进行描述。

运用Cytoscape3.8.2对结果进行可视化，构建疾病-靶点图，其他步骤与1.3节一致。

利用Metascape平台将蒲黄活性成分作用靶点进行基因本体论GO生物过程分析(GO Biological Processes)、GO分子功能分析(GO Molecular Functions)、GO细胞组分分析(GO Cellular Components)、KEGG通路富集分析(KEGG Pathway)，分析条件均为默认参数，并对所得结果进行可视化。

运用Cytoscape3.8.2对结果进行可视化，构建成分-靶点-通路图，其他步骤与1.3节一致。

为进一步明晰化合物与靶点结合的活性，利用AutoDock Vina(v4.2.6)软件对蒲黄的活性成分和关键作用靶点进行分子对接，同时将阳性药阿司匹林Aspirin与关键作用靶点进行分子对接。分子对接的步骤主要如下：①收集蒲黄活性成分作用的关键靶点的结构和活性成分的结构——从PDB数据库下载关键作用靶点的3D结构，从TCMSP和Pubchem数据库下载活性成分的mol2或3D结构；②对关键作用靶点和活性成分进行预处理——使用Discovery Studio 4.5对蛋白质结构进行处理，删除水分子、配体、离子，加极性氢和电荷等，并将化合物转成PDB文件；③配体(活性成分)和分子(靶点)的对接——对接过程中，将蒲黄活性成分和关键作用靶点的PDB文件转化成pdbqt文件，通过查阅文献设置盒子参数，而后进行柔性对接；④对接结果的可视化——使用PyMOL(2.4.1)将对接结果可视化。

利用TCMSP数据库收集33个化学成分，经ADME筛选得到8个活性成分，加上潘祥龙等^[2]报道的活性成分8个，总共16个活性成分(表 1)。

通过在线数据库对蒲黄活性成分的作用靶点进行收集，共获得539个靶点，去除重复靶点后为310个。将310个靶点录入CTD、TTD和PharmGKB数据库，对靶点进行分类，主要根据改善血流动力学、抗凝血、抗炎和调控细胞凋亡(增殖)等4个方向进行分类^[21]。最终确定与血瘀证相关的作用靶点83个，并与蒲黄16个活性成分相互作用。

为观察蒲黄活性成分和靶点之间的关系，使用Cytoscape3.8.2软件对数据进行可视化，获得成分-靶点网络图，其中节点98个，边166条(图 1)。拓扑属性分析显示，槲皮素、7-羟基-5, 8-二甲氧基-黄烷酮、山奈酚的连接度较高(表 2)。

图 1 蒲黄成分-靶点网络图 Fig. 1 Ingredients-target network diagram of Pollen typha

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通过提交靶点至STRING 11.0数据库，获得蒲黄活性成分作用靶点的PPI网络(图 2)。同时分析PPI网络拓扑属性，以连接度(Degree)为指标，连接度值越大，说明靶点连接越紧密，进而说明靶点越重要。分析结果显示，处于蒲黄活性成分作用靶点中心的蛋白，肿瘤坏死因子(TNF，度值=15)、血管内皮生长因子(VEGFA，度值=14)、转录因子(JUN，度值=14)、有丝分裂原激活蛋白激酶14 (MAPK14，度值=14)、蛋白激酶(AKT1，度值=13)、雌激素受体(ESR1，度值=10)等相互联系较为紧密，揭示蒲黄的活血化瘀网络中存在连线密度较高的子网(module)，子网由具有生物学意义的蛋白质复合体和功能模块组成^[22]，同时表明TNF、VEGFA、JUN、MAPK14、AKT1、ESR1可能为蒲黄活性成分作用的关键靶点。上述蛋白质涉及细胞增殖和凋亡、血管内皮生成、癌细胞生长的抑制、免疫反应和炎症反应的参与等方面。采用分子复合物检测算法(MCODE)对相互作用关系进行分析，得到4个module，选取与蒲黄活血化瘀药理相关的3个module (图 3)进行描述，结果发现这些module主要涉及对脂多糖的应答、炎症反应和对细菌起源分子的应答等生物过程(表 3)。推测蒲黄活血化瘀作用可能与上述过程有关。

图 2 蒲黄活性成分作用靶点PPI网络图 Fig. 2 PPI network diagram of the active ingredients action targets of P.typhae

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红色表示module 1，蓝色表示module 2，绿色表示module 3 Red represents module 1, blue represents module 2, green represents module 3 图 3 蒲黄活性成分作用靶点PPI网络中的module Fig. 3 Modules of PPI network of action targets in P.typhae active ingredients

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为了更直观地观察靶点和疾病的关系，构建疾病-靶点网络图，如图 4所示。将靶点分为7个特征病症(这7个特征病症与血瘀证对应的4个模块关联): 癌症(Cancer)、血管疾病(Vascular diseases)、免疫系统疾病(Immune system diseases)、神经系统疾病(Nervous system diseases)、炎症(Imflammation)、疼痛(Pain)及其他疾病(Other diseases)，与传统的血流动力学异常、凝血异常、炎症反应和肿瘤对应。表明蒲黄治疗血瘀证可能与7个方面的病症相关。

圆形表示靶点，八边形表示疾病 A circle represents a target, an octagon represents disease 图 4 蒲黄活性成分的疾病-靶点网络图 Fig. 4 Disease-target network diagram of active ingredients of P.typhae

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通过Metascape平台对蒲黄活性成分作用的83个靶点进行通路富集分析，并使用在线平台对前20条结果进行可视化(图 5)。蒲黄治疗血瘀证相关的生物过程主要有对脂多糖的应答(Response to lipopolysaccharide)、对受伤的反应(Response to wounding)和血液循环(Blood circulation)等(图 5a)。与血瘀证有关的通路有血管新生相关的VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)，IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)，NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)等(图 5d)。与血瘀证有关的靶点功能主要体现在蛋白激酶(Protein kinase binding)、内肽酶活性(Endopeptidase activity)、细胞因子受体结合(Cytokine receptor binding)等方面(图 5c)。与血瘀证相关的细胞组分有细胞器外膜(Organelle outer membrane)、血浆脂蛋白颗粒(Plasma lipoprotein particle)、核膜(Nuclear envelope)等(图 5b)。表明蒲黄治疗血瘀证可能与以上描述有关。

图 5 蒲黄活性成分作用靶点通路富集分析 Fig. 5 Target pathway enrichment analysis of the active ingredients action targets of P.typhae

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为系统地剖析蒲黄治疗血瘀证的潜在机制，将83个蛋白质靶点映射到前20条KEGG通路上(图 6)。结果显示，VEGF信号通路富集靶点15个，IL-17信号通路富集靶点13个，NF-κB信号通路富集靶点13个，这3个通路与血瘀证关联较紧密。这些富集多靶点的通路与血管、中枢神经系统、炎症密切相关，通路富集的靶点信息见表 4。

不同的颜色表示不同的类型，浅绿色为靶点，浅紫色为蒲黄活性成分，蓝色为通路。图形面积越大，表示该节点越重要 Different colors indicate different types. Light green is the target, light purple is the active ingredient of P.typhae, blue is the pathway.The larger the graphic area, the more important the node is 图 6 蒲黄成分-靶点-通路网络图 Fig. 6 Component-target-pathway network of P.typhae

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选取PPI网络中连接度值排前5的靶点，TNF、VEGFA、JUN、MAPK14和AKT1分别和16个与血瘀证相关的蒲黄活性成分、Aspirin进行分子对接。经研究发现，受体和配体的结合能小于-7，表示两者间具有较好的结合作用；结合能数值越低，产生相互作用所需的能量就越低^[23]。图 7为16个化合物分别与5个核心靶点进行对接的结合能。由图 7可知，结合能小于-7的有42种(49.41%)，位于-5与-7之间的有31种(36.47%)，在-1与-4.9之间的有12种(14.12%)。蒲黄成分异鼠李素-3-O-新橙皮苷、(2R)-5, 7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并吡喃-4-酮、儿茶素和表儿茶素等与受体结合可产生5个以上的氢键作用(图 8)，具有良好的活性。Aspirin与TNF的结合能最低为-6.6，与蒲黄活性成分相比稍差。结合能小于-5的表示结合活性良好^[24]，占总数的85.88%。经过分子对接验证，说明蒲黄活性成分对治疗血瘀证具有较好的活性。

颜色越红，对应的值越小，说明对接强度越大 The redder the color, the smaller the corresponding value, indicating the greater the docking strength 图 7 分子对接结果图 Fig. 7 Results of molecule docking

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图 8 蒲黄主要成分和靶点的对接结果 Fig. 8 Docking results of main ingredients and targets of P.typhae

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随着现代医学的进步，对血瘀证研究越来越深入，较古代判断疾病的“问、闻、望、切”，现代医学更多的是研究疾病的发病机制以及药物对疾病的作用机制，并已经发展到分子层面。由表 1可知，蒲黄的活性成分有81.25%是黄酮类化合物。本课题组前期实验表明，生蒲黄和蒲黄炒炭后黄酮类成分变化具有明显差异，并与药效的变化有关^[25]，可推断蒲黄总黄酮是重要的活性成分，与本文推断的结果一致。

研究分析PPI网络可知，VEGFA、AKT1、ESR1、TNF、JUN、MAPK14的连接度值在PPI网络中排名前6，说明蒲黄活性成分与这些靶点具有较高的结合活性。VEGFA是参与血管新生的相关因子，该因子可刺激血管内皮细胞分裂增殖，并与炎症指标、疾病活动及血管通透性呈正相关关系，参与固有的免疫调节^[26]。AKT1在血管细胞中是以亚型存在，影响血管化反应的多个调控途径，包括抗血管生成、调节血管通透性、血管生成反应和血管成熟^[27]。靶点ESR1调节血管系统，促进损伤血管功能的恢复，并在中枢神经系统中起保护神经的作用^[28]。以上研究成果证实PPI网络筛选的靶点可能与血瘀证密切相关，其中VEGFA、AKT1、ESR1、TNF、JUN、MAPK14可能是治疗血瘀证的关键靶点。

KEGG通路富集结果可知，在蒲黄治疗血瘀证过程中涉及的通路可能与VEGF信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路有关。如NF-κB信号通路中的促炎因子、TNF-α、AngⅡ等多种刺激因子被诱导后，在下游调节白细胞介素相关基因、凋亡抑制因子、编码黏附因子相关基因等多种基因的表达，涉及机体免疫调节、炎症反应、细胞周期调控、细胞分化及凋亡等，与Notch信号通路有关，与IKK激酶、IκB激酶的细胞内信号有关。在炎症中，TNF-α、IL-6、NF-κBP65等促炎细胞因子增加，NF-κB炎症基因的表达增加。IL-17信号通路中的IL-17F、IL-25也具有促炎作用^[29]。VEGF信号通路与下游信号联级反应，包括PI3K-Akt通路、p38-MAPK通路及Raf通路，进而控制血管内皮细胞的存活、增殖和迁移，促进血管新生并提高血管通透性。血管生成是肿瘤发生发展的重要因素，新生血管不仅为病变组织提供养分，保证其生长繁殖，而且使得肿瘤细胞与个体血液循环直接相通，进而导致恶性肿瘤的发生。上述结果表明，蒲黄治疗血瘀证可能与VEGF信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路等有关。

通过网络药理学的筛选，选取PPI网络中联系紧密的VEGFA、AKT1、TNF、JUN、MAPK14 5个靶点，分别与蒲黄活性成分对接，进一步验证其结合活性，同时将阳性药Aspirin与上述5个靶点进行对接。可视化对接结果显示, 表儿茶素与VEGFA、异鼠李素-3-O-新橙皮苷与MAPK14、儿茶素与MAPK14的结合强度较好，Aspirin与5个靶点的结合强度较表儿茶素、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、儿茶素弱。Aspirin在治疗血瘀证方面疗效明确且显著，而蒲黄活性成分的对接结果优于阳性药Aspirin，表明蒲黄在治疗血瘀证方面具有极大的潜力，开发价值较大，后续可对其进一步研究。

通过网络药理学初步揭示蒲黄多成分、多靶点、多通路的作用特点，发现蒲黄活性成分作用靶点可分为7个病症，这7个特征病症与血瘀证的4个模块相关联，预测蒲黄治疗血瘀证的可能作用靶点和代谢通路；从分子对接结果来看，蒲黄活性成分异鼠李素-3-O-新橙皮苷、(2R)-5, 7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并吡喃-4-酮、儿茶素和表儿茶素等的对接效果均优于阳性药Aspirin。本研究粗略说明了蒲黄治疗血瘀证的分子机制，不仅为蒲黄的活血化瘀作用提供了理论依据，为将来相关研究提供了基础，而且为传统中药材作用机制的研究提供新的思路。