高浓度的结晶盐类(NaCl)会限制微生物生长，通常认为极端的高盐环境如盐田、盐湖或高浓度盐溶液食物中只存在原核生物。直到2000年左右，Buchalo等^[1]和Gunde-Cimerman等^[2]从高盐环境中分离得到真菌之后，高盐生态系统及其真菌物种多样性才引起人们的注意。具有代表性的高盐生态系统有美国大盐湖，以色列、巴勒斯坦、约旦交界处的死海，以及中国新疆、青海、内蒙古等地的盐湖等^{[1, 3]}。生存在深海沉积物、盐湖、盐田、盐土和海水等高盐环境中的微生物统称嗜盐微生物。陈星宇等^[4]根据不同盐度下的生长情况，把微生物划分为不同类型：非嗜盐菌(< 1.17% NaCl)、轻度嗜盐菌(1.17%-2.93% NaCl)、中等嗜盐菌(2.93%-14.63% NaCl)、极端嗜盐菌(14.63%-30.40% NaCl)、耐盐菌(1.17%-14.63% NaCl)。我国已报道的常见嗜盐真菌有青霉属(Penicillium)^{[5, 6]}、曲霉属(Aspergillus)^{[5, 6]}、镰刀菌属(Fusarium)^{[7, 8]}、枝孢属(Cladosporium)^{[7, 8]}等类群。我国有绵延的海岸线，大多地势平坦，滩涂广阔，很适合建滩晒盐。因此，北起辽东半岛，南至海南岛，我国分布有大大小小超过1 000个盐湖/盐场。但是，我国高盐环境下的微生物多样性研究关注度还不足，相关研究仍然较少。

嗜盐耐盐真菌次生代谢产物丰富，包括酚类^[9]、甾醇类^[9]、核酸类^[10]、醌类^[10]、生物碱^[11]等单体化合物，这些化合物结构新颖，且部分具有良好的抗菌、抗肿瘤活性等。在研究耐盐真菌P.chrysogenum HK14-01的次生代谢产物中，曲鹏等^[12]发现化合物(2S, 3R)-oxaline、(Z)-N-(4-hydroxystyryl) formamide和(E)-N-(4-hydroxystyryl) formamide对大肠杆菌(Escherichia coli)表现出抑菌活性，化合物(2S, 3R)-oxaline和emodin对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)表现出抑菌活性，化合物emodin还能微弱地抑制小鼠白血病悬浮细胞(P388)的增殖。对于耐盐真菌Wallemia sebi PXP-89，Peng等^[11]发现其次生代谢产物对产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)具有抗菌活性，最小抑菌浓度为76.7 μmol/L。刘培培等^[13]从内蒙古盐湖的沉积物中筛选出一株耐盐真菌Aspergillus variecolor B-17，其具有明显的细胞毒活性(小鼠乳腺癌细胞株tsFT210)和海虾(Artemia salina Leach)致死活性；从该菌发酵产物的石油醚层提取物中分离出的3个单体化合物[2-(E-1-庚烯基)-3, 6-二羟基-5-(3-甲基-2-丁烯基)苯甲醛、2-庚基-3, 6-二羟基-5-(3-甲基-2-丁烯基)苯甲醛、2-(E, E-3, 5-庚二烯基)-3, 6-二羟基-5-(3-甲基-2-丁烯基)苯甲醛]，对P388、A549、HL-60和BEL-7402肿瘤细胞表现出弱的细胞增殖抑制活性，半抑制浓度IC₅₀值分别为88、68、66、65 μmol/L，9、99、110、84 μmol/L以及77、147、93、203 μmol/L。

北海竹林盐场是广西最大的海晶盐生产基地，制盐历史悠久。陈显强等^[14]于2019年5月从北海竹林盐场的海盐田中分离得到26株嗜盐真菌，鉴定为3科4属11种，其中青霉菌属菌株为优势菌群；菌株Epicoccum sorghinum GXIMD02001具有靶向FGFR2抗肿瘤作用，Aspergillus versicolor GXIMD02004和Penicillium citrinum GXIMD02009等具有抑制乳腺癌细胞增殖的作用。为研究冬季北海海盐田嗜盐真菌的物种多样性，本课题组于2020年11月底从广西北海竹林盐场的饱和盐水区域采集样品，采用两种高盐培养基——高盐虎红培养基和高盐马铃薯葡萄糖培养基进行菌株筛选分离；同时，使用4种致病菌[耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，SE)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，SA)和海豚链球菌(Strepstococcus iniae，SI)]作为指示菌，对嗜盐真菌发酵提取物的抗菌活性进行评价，从而得到具有潜在抗菌活性的菌株，为北部湾嗜盐真菌资源的开发利用奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 培养基

培养基均经121 ℃高温高压灭菌30 min后使用，配方如下。

(1) 分离培养基

高盐虎红培养基(RBM)：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，KH₂PO₄ 1.0 g，MgSO₄ 0.5 g，孟加拉红0.033 g，琼脂粉15.0 g，氯霉素0.1 g，含10%海盐的人工海水1 000 mL。

高盐查氏琼脂培养基(CDA)：NaNO₃ 3.0 g，K₂HPO₄ 1.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO₄ 0.01 g，蔗糖30.0 g，琼脂粉15.0 g，氯霉素0.1 g，含10%海盐的人工海水1 000 mL。

(2) 纯化培养基

高盐马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯提取粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂粉15.0 g，含10%海盐的人工海水1 000 mL。

(3) 发酵培养基

高盐马铃薯葡萄糖培养基(PD)：马铃薯提取粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，含10%海盐的人工海水1 000 mL。

1.1.2 采样信息

2020年11月27日在广西北海竹林盐场选取6个饱和盐度的采样点进行采样(表 1)，采集的样品放入无菌袋中，无菌袋放入装有冰袋的隔温箱里带回实验室，当天进行菌株分离。

1.1.3 指示菌

指示菌包括两种人类致病菌——耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，两种水产养殖致病菌——无乳链球菌和海豚链球菌，均由华南农业大学海洋学院张晓勇副教授惠赠。

1.2 方法 1.2.1 真菌分离

沉积物样品取约2 g，加入2 mL无菌水，研磨混匀，即为样品原液；水池水/盐田水直接作为样品原液。用无菌海水将样品原液稀释成1∶10、1∶100的样品悬液。各取100 μL两种浓度样品悬液涂布于分离培养基中，置于25 ℃恒温培养箱培养12 d。用灭菌竹签挑取形态不同的单菌落接种于PDA培养基上，纯化菌株。

1.2.2 真菌鉴定

在超净工作台中从培养平板上刮取一定量的菌丝体和孢子，放入无菌的1.5 mL离心管中。离心管中加入0.2% NaOH溶液，沸水浴5 min，-80 ℃条件下冷冻10 min。取破壁后的菌液进行PCR扩增，扩增体系为25 μL，其中模板DNA 0.5 μL，Buffer(含Mg²⁺) 2.5 μL，dNTP 1 μL，Easy taq酶0.2 μL，引物ITS1和ITS4各0.5 μL，ddH₂O补足至25 μL。PCR扩增程序：预变性94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；修复延伸72 ℃ 10 min；终止反应4 ℃ 10 min。取5 μL扩增产物使用1%琼脂凝胶电泳检验，并用Bio-RDS凝胶成像仪观察电泳结果。将有荧光反应的PCR扩增产物进行ITS-rDNA测序。所有ITS测序结果使用Seqman软件分析剪切，之后将剪切后的ITS序列上传至NCBI核酸序列数据库与已知序列进行比对，选择相似性高的序列进行分析。使用MEGA-7软件，采用邻接法(Neighbor-Joining，N-J)构建系统发育树。将形态学观察结果与序列对比结果相结合进行分类、排重，将具有代表性的真菌ITS序列上传到GenBank，获取登录号。

1.2.3 菌株发酵提取物的制备

将纯培养所得菌株接种于PD培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养7 d。将等体积乙酸乙酯加入真菌PD培养基中，40 kHz超声提取20 min，真空抽滤，静置分层并弃去水层，将乙酸乙酯层减压浓缩后得到提取物。使用二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)作为助溶剂，将提取物溶解成1.28 mg/mL的药液，备用。

1.2.4 抑菌活性的测定

采用96孔板法测定菌株发酵提取物对MASA、SE、SA和SI 4种指示菌的抑菌活性^[15]。活化后的指示菌接种于LB培养基，30 ℃、180 r/min振荡培养至对数生长期，调整指示菌悬液浓度为1×10⁶ CFU/mL。96孔板中加入195 μL指示菌悬液，再加入5 μL药液，混匀，使用二倍稀释法将药液稀释。每个孔混匀密封后，于37 ℃培养箱中培养24 h，使用酶标仪于600 nm处测定OD值。青霉素G和氯霉素为两种阳性对照，初浓度都为1 mg/mL，同时设置阴性对照(DMSO)和空白对照(LB培养基)。每个样品设置3个平行样，样品抑菌活性结果用最小抑菌浓度表示，最小抑菌浓度为抑制90%受试菌所需要的最低药物浓度(90% Minimal Inhibitory Concentration，MIC₉₀)。抑制率(%)=(阴性对照吸光值-样品吸光值)/阴性对照吸光值×100%。

2 结果与分析 2.1 可培养真菌的分离结果

对采集的饱和盐度样品进行分离纯化，得到16株可培养极端嗜盐真菌，1至6号采样地点菌株数量分别为2、6、0、4、3、1株。其中，在盐田排水池沉积物中分离得到的真菌数量最多。

2.2 可培养真菌的多样性

从竹林盐场中分离得到16株真菌，根据菌落形态特征差异进行分类后，对其中12株具有代表性的真菌进行DNA提取和PCR扩增，将菌株的ITS序列经BALST比对，找到与其相似度达97%以上的匹配序列。比对检索结果得到12种极端嗜盐真菌，分属于6科6属，其中丛梗孢科(Moniliaceae)枝孢菌属(Cladosporium)3种，黑粉菌科(Ustilaginaceae)黑孢霉属(Nigrospora)3种，瘤座孢科(Tuberculariaceae)镰刀菌属(Fusarium)3种，格孢腔菌科(Pleosporaceae)链格孢属(Alternaria)1种，暗色孢科(Dematiaceae)弯孢属(Curvularia)1种，隔孢假壳科(Didymosphaeriaceae)Paraphaeosphaeria属1种(表 2，图 1)。

2.3 抑菌活性结果

真菌发酵提取物抗MASA、SE、SA和SI活性结果如表 3所示，其中F.incarnatum GXIMD00527的发酵提取物对4种指示菌都具有极强的抑菌活性(MIC₉₀ < 3.125 μg/mL)，其活性作用与阳性对照氯霉素相当；真菌F.chlamydosporum GXIMD00541发酵提取物对4种指示菌的抑菌活性较好(MIC₉₀ < 6.25 μg/mL)；真菌Alternaria alternata GXIMD00532、Cladosporium cladosporioides GXIMD00533、Curvularia hawaiiensis GXIMD00538发酵产物对MRSA有一定的抑菌活性(MIC₉₀≤25 μg/mL)，对其他3种指示菌表皮葡萄球菌、海豚链球菌和无乳链球菌抑菌活性较弱(MIC₉₀>25 μg/mL)。

3 讨论

为了研究北海竹林盐场极端嗜盐真菌的物种多样性，本课题组于2020年11月在广西北海竹林盐场饱和盐度采样地采集样品，分离得到可培养极端嗜盐真菌16株，鉴定为6科6属12种。陈显强等^[14]从2019年5月采集的北海竹林盐场海盐田样品中分离得到26株嗜盐真菌，鉴定为3科4属11种，其中青霉菌属和曲霉属为优势种属，占比分别达到55%和27%。本研究所得嗜盐真菌物种与陈显强等^[14]的报道相比，两者均分离得到链格孢属(Alternaria)菌株。但不同的是，本研究分离得到的极端嗜盐真菌物种更丰富，并且优势种属不同，为枝孢菌属(3种)、黑孢霉属(3种)、镰刀菌属(3种)。上述结果表明，不同季节的北海竹林盐场极端嗜盐真菌物种多样性不同。在培养基不变的条件下，增加采样季节，可以更系统地研究北海海盐田极端嗜盐真菌的物种多样性。

本研究发现两株抗菌活性显著的镰刀菌属真菌F.incarnatum GXIMD00527和F.chlamydosporum GXIMD00541。镰刀菌属真菌广泛分布于土壤和有机体内，研究者从不同地域、样品中分离、鉴定出大量的镰刀菌属真菌^[16]。该属真菌常常产生有毒物质，如镰刀属真菌毒素会污染食物或牲畜饲料，引发人类或动物的疾病^[17]。镰刀菌属真菌除了产生有毒物质外，还拥有较为丰富的次生代谢产物，如生物碱、肽类、酰胺类、萜类、醌类、吡喃酮等，这些代谢产物具有抗肿瘤、抗菌等活性，因此该属真菌具有探索天然活性代谢产物的价值^[18]。

嗜盐真菌为了适应极端环境，进化出了特殊的代谢途径。长期生存在高盐环境下，嗜盐真菌有着与普通环境中真菌不一样的生理特性：高盐环境中的Na⁺对嗜盐真菌细胞膜的结构稳定、细胞壁的结构完整和功能起着重要的作用。此外，嗜盐真菌细胞存在质膜、色素、H⁺泵、酶，使得嗜盐真菌具有在高盐极端环境下生存的能力^[1]。特殊的生理机制造就了嗜盐真菌次生代谢产物丰富、结构新颖、活性优良的特点。本研究中镰刀菌属嗜盐真菌F.incarnatum GXIMD00527、F.chlamydosporum GXIMD00541的乙酸乙酯粗提物具有极好的抑菌活性，目前的研究仅仅局限于粗提物的活性测定，今后将以抑菌活性为导向，探讨两株镰刀菌属嗜盐真菌的具体活性成分。

4 结论

本研究分离得到可培养极端嗜盐真菌16株，鉴定为6科6属12种。枝孢菌属、黑孢霉属、镰刀菌属、弯孢属、Paraphaeosphaeria属为首次从北海竹林盐场中分离得到，丰富了北海竹林盐场嗜盐真菌的物种多样性。本研究考察了北海竹林盐场嗜盐真菌的抑菌活性，其中镰刀菌属真菌F.incarnatum GXIMD00527、F.chlamydosporum GXIMD00541的发酵产物对4株测试细菌均表现出显著的抑菌活性，后续可进一步扩大发酵研究，探究其活性成分。本研究丰富了嗜盐真菌的物种多样性，为北部湾嗜盐真菌资源的进一步开发利用提供了菌种支持。