广山楂叶为蔷薇科Rosaceae苹果属Malus植物台湾林檎Malus doumeri (Bois.) A.Chev.或光萼林檎M.leiocalyca S.Z.Huang的干燥叶子^[1-11]。广山楂也叫大果山楂^[9-12]，目前关于广山楂的公开报道主要集中在台湾林檎，对光萼林檎的研究几乎没有报道^[6]。广山楂广泛分布于我国中部和南部地区^[11]，以及越南、老挝等东南亚地区^[9]。由于具有耐寒、喜光、耐旱、耐贫瘠、生命力强、适应性广的特性，广山楂可在土山或石山地区种植^{[12, 13]}。广山楂叶可作为药材，收录于《广西中药材标准》^[1]、《广西道地药材》^[2]、《广西道地药材目录》^[3]、《广西壮瑶等少数民族药材目录》^[3]、《广西壮族自治区壮药质量标准：第二卷2011年版》^[4]。广山楂叶性平，味微甘微苦、微芬芳，主要功效是开胃、去湿、消滞、活血化瘀等^[6-8]。除了可药用，广山楂叶中含有蛋氨酸、苏氨酸、维生素C、维生素E等多种营养成分，此外还含有黄酮类、三萜类、皂苷、甾醇类和有机酸等多种活性成分^[14]，民间常用广山楂叶泡茶作为饮料^{[7-10, 14, 15]}，因此可将其用作代用绿茶、红茶、黑茶等普通食品和保健食品原料。但目前广山楂叶尚未进入食药同源名录，对其毒理安全研究不足，仅见有尹利君等^[10]、金雪萍^[16]开展的初步试验。急性经口毒性和遗传毒性是《食品安全国家标准食品安全性毒理学评价程序》^[17]的必要部分，而国内外迄今未见有广山楂叶遗传毒性试验的公开报道，因此本研究以广山楂叶水提取物为对象，进行急性经口毒性和3项遗传毒性试验，为广山楂叶在食品产业中的安全应用提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 样品及处理

将新鲜采摘的成熟广山楂叶[产地：广西昭平县，经广西壮族自治区药用植物园余丽莹研究员鉴定为台湾林檎M.doumeri (Bois.) A.Chev.]杀青、干燥后制成干茶叶，放在温度不高于25 ℃、相对湿度45%-75%、无阳光直射处保存备用。称取样品500 g，加入5 000 mL 85 ℃的纯水持续保温浸提30 min，过滤得到滤液；对滤渣重复浸提并再过滤1次，合并滤液，减压浓缩至500 mL，即为1.0 g/mL的样品提取液(以干品计，下同)。将样品提取液置冰箱备用，试验前用纯水制备成受试液^[18]。

1.2 试验菌种

美国MOLTOX公司提供编号为TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535的组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium。使用前各菌株特性经鉴定均符合试验要求。

1.3 试验动物及环境

SPF级昆明种小鼠(长沙市天勤生物技术有限公司)。动物房环境为屏障系统，22-25 ℃的室温，55%-70%的相对湿度。

1.4 主要仪器与设备

电子天平(型号：SK 5001WP，日本A & D株式会社)，电子分析天平(型号：BS224S，德国赛多利斯科学仪器有限公司)，全自动血细胞分析仪(型号：Sysmexi XT-2000i，日本希森美康株式会社)，全自动生化分析仪(型号：OLYMPUS AU400，日本奥林巴斯株式会社)，荧光倒置显微镜(型号：CX41，日本奥林巴斯株式会社)。

1.5 主要试剂

动物饲料(长沙市天勤生物技术有限公司)。生化级试剂：小牛血清(上海远慕生物科技有限公司)，营养琼脂、琼脂粉(北京陆桥技术股份有限公司)，大鼠肝微粒体酶(S₉，经多氯联苯诱导，江苏齐氏生物科技有限公司)。分析纯试剂：叠氮钠(美国Sigma-Aldrich公司)，二甲基亚砜(DMSO)、环磷酰胺、2-氨基芴、敌克松、柔红霉素、1, 8-二羟基蒽醌、秋水仙素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.6 方法

参考《食品安全国家标准食品安全性毒理学评价程序》^[17]的评价要求来进行急性经口毒性和遗传毒性试验，方法略有修改。

1.6.1 小鼠急性经口毒性试验

采用限量法试验，选4周龄的昆明种小鼠20只(18-22 g/只)，雌、雄性各10只。试验前动物禁食6 h，不限饮水。给动物灌胃1.0 g/mL的样品提取液1次，每只动物的最终剂量为20 000 mg/kg BW。灌胃后观察并记录动物是否有中毒症状表现。连续观察14 d，期间每周称重1次，试验结束后立即解剖小鼠，对动物进行大体观察，如发现肝、肾等器官出现体积、颜色、质地等明显改变时，则对改变器官进行组织病理学检查^[19]。

1.6.2 细菌回复突变试验(Ames试验)

采用平板掺入法。设8、40、200、1 000、5 000 μg/皿5个剂量组，另设4种对照试验组：自发回变对照、水对照、DMSO溶剂对照和阳性突变剂对照^[20]。使用6种阳性突变剂：10 μg/皿的2-氨基芴[作用于添加大鼠肝微粒体酶(S₉)的TA97a、TA98、TA100]、50 μg/皿的1, 8-二羟基蒽醌(作用于添加S₉的TA102)、200 μg/皿的环磷酰胺(作用于添加S₉的TA1535)、6 μg/皿的柔毛霉素(作用于未添加S₉的TA98)、1.5 μg/皿的叠氮钠(作用于未添加S₉的TA100、TA1535)、50 μg/皿的敌克松(作用于未添加S₉的TA97a、TA102)。所有试验组均各做3个平行，统计各组每皿的菌落数。若受试物的回变菌落数多于自发回变菌落数2倍以上，并呈现剂量-反应关系，则可以判定诱变试验结果为阳性^[20]。

1.6.3 小鼠骨髓红细胞微核试验

以经口灌胃方式开展两次试验，中间间隔24 h。取5周龄的昆明种小鼠50只，雌雄小鼠体质量均为25-30 g，按照动物性别随机分为5组，每组雌雄各5只。设2 500、5 000、10 000 mg/kg BW共3个剂量组，阳性对照是40 mg/kg BW环磷酰胺，阴性对照为纯水^{[20, 21]}。第二次灌胃受试液和对照溶剂24 h后，使用颈椎脱臼法处死小鼠，取胸骨骨髓，用小牛血清稀释涂片、甲醇固定、Giemsa染色后再利用显微镜检查^{[20, 21]}，每只小鼠观察2 000个嗜多染红细胞(PCE)，统计含有微核的细胞数，并计算PCE的微核率；另外观察200个PCE，在同一视野内统计所见的正染红细胞(NCE)数目，PCE数和NCE数的总和即为总红细胞(RBC)数，计算PCE/RBC比值^[21]。

1.6.4 小鼠精原细胞染色体畸变试验

选30只7周龄的SPF级雄性昆明种小鼠，体质量30-35 g，按照随机方式将试验小鼠划分为5组，其中高剂量组(10 000 mg/kg BW)的小鼠数量为10只，其余4组则均为5只。受试液剂量组、阳性对照组、阴性对照组的设置和操作同1.6.3节，以经口灌胃方式进行。

对于高剂量组，在给受试液后，一批5只在24 h后处死，另一批5只在48 h后处死；其他组各5只均在24 h后处死。各试验组动物处死前4 h，各小鼠分别经腹腔注射0.5 mg/mL的秋水仙素(现配现用)以阻断细胞中期分裂，剂量均为5 mg/kg BW。颈椎脱臼法处死各组动物，从两侧睾丸取出精子，进行细胞涂片、固定、染色后再使用显微镜鉴别观察^[21]。每只小鼠统计100个中期分裂相细胞，油镜下观察精原细胞染色体的数量和结构变化；另外对1 000个精原细胞进行观察，分析其有丝分裂指数，记录每只小鼠的染色体结构畸变细胞数，以及每个细胞中的染色体畸变数，进而观察统计各试验组细胞的染色体结构畸变类型及其数量，以及细胞畸变的频率(染色体裂隙不计入畸变率)^[21]。畸变细胞率(%)=畸变细胞数/观察细胞数×100%。

1.7 数据处理

采用SPSS 20.0软件对试验数据进行统计分析(用x±s表示数据统计结果，骨髓红细胞微核试验用泊松分布均数比较法，精原细胞染色体畸变试验用二项分布统计)，显著水平为0.05，极显著水平为0.01。

2 结果与分析 2.1 急性经口毒性试验

从表 1可见，以20 000 mg/kg BW剂量的受试液灌胃小鼠后，小鼠均未出现中毒症状，生长发育良好，连续观察14 d均无小鼠死亡现象。试验结束后大体解剖观察动物肝、肾、脾、心等主要脏器均未见明显异常改变。由此可知，受试液对小鼠急性经口毒性半数致死量LD₅₀大于20 000 mg/kg BW(如按60 kg体重的成人推荐食用量即每人每日5 g，用该半数致死量结果换算后，该剂量相当于人体推荐食用量的240倍)。根据《食品安全国家标准急性经口毒性试验》^[22]剂量分级标准，该样品的急性经口毒性属实际无毒级。

2.2 细菌回复突变试验

经观察发现，所有试验平皿均无杂菌污染，背景菌苔生长正常，无沉淀生成。由表 2可知，不管是最低剂量(8 μg/皿)还是最高剂量(5 000 μg/皿)，同一试验菌株、相同试验条件下，受试液各剂量组之间的菌落数相近；5个剂量组5种试验菌株的菌落数与对应的自发回变组、溶剂对照组(水、DMSO)菌落数也相差不大，但与对应的阳性对照组菌落相差显著(P＜0.05)，即不管S₉使用与否，本试验系统对致突变物是有效且敏感的，5个剂量组的回变菌落数均不大于自发回变组菌落数的两倍，而且也没有表现出剂量-反应关系。按《食品安全国家标准细菌回复突变试验》^[23]评判，试验结果为阴性。经重复试验验证，结果也为阴性(表 3)，即受试液均未引起5种组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌基因突变，未出现遗传毒性。

2.3 小鼠骨髓红细胞微核试验

由表 4可知，对比阴性对照组，受试液各剂量组试验动物骨髓嗜多染红细胞微核率均未表现出显著差异(P＞0.05)，微核率总体上不高于阴性对照组。虽然雌小鼠的低、高两个剂量组的微核率分别略高于阴性对照组，但是该结果可能是试验的随机误差所致，低、中、高3个剂量组微核率差别很小，且呈随机分布，无剂量-反应关系。阳性对照组的微核率均值(雄、雌小鼠，下同)为21.7‰，对比阴性对照组的微核率均值1.5‰，两者之间有非常显著的差异(P＜0.01)。另外，各剂量组的PCE/RBC与阴性对照组之间无明显差异，且无剂量-反应关系：各剂量组之间PCE/RBC差别极小，均值为52.4%；与阴性对照组PCE/RBC均值52.7%相比，各剂量组PCE/RBC均不低于对照组的20%。依据评价标准^[24]，试验条件下广山楂叶水提取物对小鼠骨髓红细胞无致损伤和抑制作用。

2.4 小鼠精原细胞染色体畸变试验

如表 5所示，高剂量组(24和48 h)、中剂量组和低剂量组(24 h)的染色体数目改变、结构改变、畸变细胞率和有丝分裂指数基本相同，不随着剂量浓度和作用时间变化。各剂量组与阴性对照组之间的指标也很相近，无显著性差异(P＞0.05)，但阳性对照组与阴性对照组在畸变细胞率方面则表现出了极显著差异(P＜0.01)。所以，各剂量组与阴性对照组相比均无显著差异，更无剂量-反应关系。以上结果表明，染色体损伤和致畸作用并非由广山楂叶水提取物对小鼠精原细胞的试验引起。

3 讨论 3.1 广山楂叶的急性经口毒性与提取溶剂、灌胃持续时间等因素关系

金雪萍^[16]采用最大耐受剂量法对林檎叶进行试验，样品分别经纯水、乙醇提取以及经纯水、乙醇提取后再经酸、碱、乙酸乙酯等溶剂提取，提取液分别灌胃7 d后发现纯水提取液、乙醇提取液处理组均未见动物死亡，表现为实际无毒；但是使用乙醇提取后再通过酸溶解的提取物是有毒性的，LD₅₀为2.12 g/mL^[16]，按动物体重折算为42 400 mg/kg BW。由于最大耐受剂量法在2014年发布的《食品安全国家标准急性经口毒性试验》^[22]中已经被删除，本研究采用现行有效的限量法试验，将广山楂叶用纯水浸提后动物灌胃14 d，结果提示样品LD₅₀大于20 000 mg/kg BW，研究所涉及的提取溶剂、灌胃持续时间与金雪萍^[16]不同，但是水提取物试验的结论一致，均没有急性毒性。

3.2 Ames试验剂量设计

Ames试验是评价基因突变的一种经典的体外试验方法^[25-27]。本试验样品经过纯水浸提获得，水溶解性好，设计剂量已达到《食品安全国家标准细菌回复突变试验》^[23]对细菌回复突变试验剂量最高推荐量为5 mg/皿的要求，试验结果并未观察到诱变作用，可能原因是试验样品的剂量浓度不够大，或试验样品不存在诱变物质，或即使试验样品可能存在诱变物质，但是不能被原核生物鼠伤寒沙门氏菌利用^[23]。鉴于此，从食品安全评价的角度考虑不必再提高样品剂量浓度，同时也说明样品无诱变作用，试验设计和结果均满足要求。

3.3 染色体畸变异常现象

染色体畸变试验作为致基因突变的有效检测手段，是评价机体或培养细胞被外源性化学物质作用后引发遗传物质损伤的方法，其遗传学终点是染色体分离、完整性改变^[21]。本试验中，低剂量组(2 500 mg/kg BW)出现的畸变细胞率和有丝分裂指数分别低于阴性对照的0.2%和0.1，极有可能是因为精原细胞染色体畸变试验存在一定的随机误差^[28]，也可能是秋水仙素有一定毒性导致的染色体变化^[29]。试验同时发现，各剂量组的染色体结构改变主要体现在染色体裂隙和断裂，而微小体、环形、多着丝点、单体互换、非特定形等改变均未发现，这与以纯水作为阴性对照组的表现一致，因此上述变化主要为生物细胞自发突变所致，与受试样品的致突变作用无直接关系。

4 结论

本研究为验证广山楂叶水提取物的急性经口毒性，首次开展了3项遗传毒性试验，包括细菌回复突变、小鼠骨髓红细胞微核试验、精原细胞染色体畸变试验，结果表明广山楂水提取物属实际无毒级，未观察到其遗传毒性。本研究为广山楂叶用作食品、保健食品原料的开发利用提供安全毒理学支撑。