0 引言

条斑紫菜(Pyropia yezoensis)隶属红藻门(Rhodophycophyta)、红藻纲(Rhodophyceae)、红毛菜亚纲(Bangiophycidae)、红毛菜目(Bangiales)、红毛菜科(Bangiacesae)、紫菜属(Pyropia)^[1]，广泛栽培于我国江苏、山东沿海地区，年总产值超50亿美元^[2]。条斑紫菜生活史包括叶状体和丝状体两个时期^[3]，丝状体时期包括营养藻丝(丝状藻丝)、孢子囊枝(膨大细胞)、壳孢子形成与放散^[4]，其中营养藻丝粉碎后可钻入含钙质的基质长成贝壳丝状体，在栽培生产中属于种苗阶段^[5]。营养藻丝在无附着基质的人工培养条件下可生长发育成自由丝状体(游离丝状体)^[6]。目前，随着我国条斑紫菜新种质的不断开发和推广，越来越多的生产单位采用自由丝状体营养藻丝接种贝壳，用于贝壳丝状体育苗^[7]。因此，对条斑紫菜自由丝状体进行快速扩繁的研究显得至关重要。

20世纪60年代，国内外研究学者对紫菜丝状体的生长发育及其与培养环境间的关系进行研究。例如，以条斑紫菜贝壳丝状体为研究对象的：Iwasaki^[8]认为紫菜丝状体的生长对光照强度有一定的要求；日本藻类学者黑木宗尚等^[9]曾报道直射光对紫菜丝状体有致命伤害；我国研究学者郑宝福等^[10]、任国忠等^[11]分别报道光照强度、温度对条斑紫菜丝状体生长发育的影响。以条斑紫菜自由丝状体为对象的：骆其君等^[12]研究温度、光照强度、盐度和营养盐对条斑紫菜自由丝状体生长的影响；朱建一等^[13]在悬浮培养条件下，比较光照、光照时间对条斑紫菜丝状体生长的影响；张美如等^[14]报道条斑紫菜丝状体扩增的最适营养盐浓度；郭文竹^[15]系统研究温度、光照强度、海水比重、光暗周期对条斑紫菜丝状藻丝生长的影响；魏家慧等^[16]研究条斑紫菜营养藻丝和孢子囊枝阶段对光照、温度的光合适应能力；侯和胜等^[17]报道了高温胁迫对条斑紫菜丝状体的生长和生理影响。然而，光照强度对条斑紫菜自由丝状体生理特性的研究较少，因此本研究以光照强度作为单一变量，研究不同光照强度下条斑紫菜自由丝状体营养藻丝的生长和生理特性变化，以期筛选出最适宜其生长的光照强度，为丰富条斑紫菜自由丝状体的快速扩繁提供科学参考。

1 材料与方法 1.1 材料

采用江苏省海洋水产研究所培育的条斑紫菜新品种“苏通1号”自由丝状体营养藻丝为供试材料。

1.2 方法 1.2.1 藻体培养

试验于光照培养箱(MGZ-120B-3，上海丙林电子)中进行。称取条斑紫菜自由丝状体营养藻丝(0.3±0.01) g，分别置于5，15，30，45，60，75 μmol·m^-2 · s^-1光照强度下培养，每组设置3个平行，用PLA-20植物光照分析仪进行光照强度测定。其他培养条件为光周期16 L∶8 D，温度(18±0.5)℃，盐度26。培养期间每天定时摇动培养瓶2次(10:00，16:00)，每隔5 d更换一次加富海水(PES)营养液^[18]，并称量藻体鲜重，培养时间为25 d。

1.2.2 藻体特定生长率的测定和显微观察

每5 d更换培养液时，称量各个培养瓶内条斑紫菜自由丝状体营养藻丝的鲜重(Fresh Weight，FW)，具体方法如下：将自由丝状体营养藻丝经150目筛绢过滤后，放于滤纸上吸干水分，置于电子分析天平上称重记录。按以下公式计算各组样品的特定生长率(Specific Growth Rate, SGR)：SGR(%) = 100×(lnS_T－lnS_T-5)/5，其中：S_T为第T天藻体鲜重，S_T－5代表前一次称量时的藻体鲜重。

采用Nikon-Eclipse Ni光学显微镜(日本尼康公司)对培养25 d后的自由丝状体营养藻丝进行形态观察和显微拍照。

1.2.3 叶绿素a和类胡萝卜素含量测定

培养至25 d时，将条斑紫菜自由丝状体营养藻丝按照1.2.2节方法称量。称取0.1 g藻体，暗光条件下置于甲醇(100%)溶液中研磨粉碎；避光过夜后于4℃、10 000 r·min^-1条件下离心10 min，取上清液，用紫外可见分光光度计(UV-2450，日本岛津公司)测定上清液的吸光值OD。叶绿素a和类胡萝卜素含量测定分别参照Porra^[19]和Parsons等^[20]报道的方法，具体计算公式如下：

$ \begin{array}{l} 叶绿素{\rm{a }}(\mu {\rm{g}}\cdot{\rm{m}}{{\rm{L}}^{ - 1}}) = {\rm{ }}16.29{\rm{ }} \times (O{D_{665}} - \\ O{D_{750}}) - 8.54 \times (O{D_{652}} - O{D_{750}}){\rm{ }}, \end{array} $

$ \begin{array}{l} 类胡萝卜素{\rm{ }}(\mu {\rm{g}}\cdot{\rm{m}}{{\rm{L}}^{ - 1}}) = 7.6 \times \left[ {(O{D_{480}} - } \right.\\ \left. {O{D_{750}}) - 8.54 \times (O{D_{510}} - O{D_{750}})} \right] \end{array} $

1.2.4 藻胆蛋白含量测定

培养至25 d时，将条斑紫菜自由丝状体营养藻丝按照1.2.2节方法称量。称取0.1 g藻体，置于8 mL 0.1 mol·L^-1磷酸缓冲液(pH值为6.8)中研磨，然后放入4℃冰箱中(避光保存)，静止24 h后于4℃、10 000 r·min^-1条件下离心10 min，取上清液，用紫外分光光度计检测样品上清液在455，564，592，618，645 nm波长下的吸光值。按照Beer等^[21]报道的方法计算藻红蛋白(PE)和藻蓝蛋白(PC)含量，计算公式如下：

$ \begin{array}{l} {\rm{PE(mg}} \cdot {{\rm{g}}^{{\rm{ - 1}}}}{\rm{) = }}\\ \frac{{[({A_{564}} - {A_{592}}) - 0.20 \times ({A_{455}} - {A_{592}}){\rm{ }}]}}{{{\rm{FW}}}} \times V \end{array} $

$ \begin{array}{l} {\rm{PE(mg}} \cdot {{\rm{g}}^{{\rm{ - 1}}}}{\rm{) = }}\\ \frac{{[({A_{618}} - {A_{645}}) - 0.51 \times ({A_{592}} - {A_{645}}){\rm{ }}]}}{{{\rm{FW}}}} \times V \end{array} $

式中：A表示吸光度，V代表抽提量，FW为藻体鲜重(g)。

1.2.5 最大量子效率测定

采用调制叶绿素荧光仪(PAMⅡ，德国WALZ公司)测定藻体光系统Ⅱ(PSⅡ)最大量子效率F_v/F_m。测量方法如下：藻体于EP管中进行30 min暗适应后，打开测量光(约0.3 μmol·m^-2 · s^-1)，测得样品最小荧光值(F_o)，随后提供0.8 s约4 000 μmol·m^-2· s^-1饱和脉冲光，测得最大荧光值(F_m)，依据公式获得最大量子效率(F_v/F_m)：

$ {F_v}/{F_m} = ({F_m} - {F_o})/{F_m}。$

1.3 数据处理

采用Graph Pad Prism 7.0和Origin 7.0软件进行数据处理及统计分析，用One-Way ANOVA检验差异显著水平，设显著水平为P < 0.05。

2 结果与分析 2.1 条斑紫菜自由丝状体营养藻丝的特定生长率

由图 1可知，初始培养5 d后，不同光照强度处理下条斑紫菜自由丝状体营养藻丝都处于较快的生长状态，其中75 μmol·m^-2 · s^-1光照强度培养下的藻体SGR最大，为8.78%，但与其他试验组间无显著性差异(P>0.05)。培养10 d后，各试验组藻体生长开始出现差异，60 μmol·m^-2 · s^-1光照强度培养下的SGR最大，分别约为5，15 μmol·m^-2 · s^-1组的4.18倍和12.57倍(P < 0.05)。15 d后，30-75 μmol·m^-2 · s^-1光照强度培养下的藻体SGR明显大于5，15 μmol·m^-2 · s^-1组(P < 0.05)；而20 d后，15 μmol·m^-2 · s^-1光照强度培养下藻体表现出明显的生长优势(P < 0.05)，5，30，45，60 μmol·m^-2 · s^-1光照强度培养下的藻体生长减缓，75 μmol·m^-2 · s^-1光照强度培养下藻体SGR出现负增长。培养25 d后，15 μmol·m^-2 · s^-1光照强度培养下藻体SGR最大，生长速率明显快于60，75 μmol·m^-2 · s^-1组(P < 0.05)。

2.2 条斑紫菜自由丝状体营养藻丝的生长形态变化

光照强度对条斑紫菜自由丝状体营养藻丝的形态存在一定影响。初始培养的藻体呈深褐色，细胞为细长圆柱形，色素体为侧生带状。但随着培养时间的延长，不同光照强度下藻体色泽、形态和色素体等细胞内含物的分布逐渐发生变化。培养25 d后，5 μmol·m^-2·s^-1光照强度下，藻体呈深褐色，细胞内含物较满，色素体清晰可见，色素体大且弥散在细胞四周(图 2a)。15 μmol·m^-2·s^-1光照强度下，丝状藻丝颜色暗黑色，藻丝长且粗壮，色素体饱满，带状充盈分布在细胞四周，藻体处于健康生长状态(图 2b)。30 μmol·m^-2·s^-1光照强度下，藻体色泽略微暗淡，色素体浅黄色且偏于一侧，有些藻丝的侧枝或顶端已形成膨大细胞(图 2c)。45 μmol·m^-2·s^-1光照强度下，藻丝颜色趋于淡黄色，细胞色素体内容物外溢呈半中空状，在藻丝顶端或侧枝细胞已形成2-10个单条或不规则分枝的膨大细胞(图 2d)。60 μmol·m^-2·s^-1光照强度下，丝状体颜色趋于黄色，色素体部分降解，颜色偏淡，营养藻丝顶端及侧枝进一步发育变宽，膨大细胞比例增大(图 2e)。75 μmol·m^-2·s^-1光照强度下，藻体色泽灰白，细胞内含物较贫乏，色素体分解，完全呈中空状态，且藻丝之间裹着大量硅藻(图 2f)。

2.3 条斑紫菜自由丝状体营养藻丝的光合色素及藻胆蛋白含量比较

如图 3所示，不同光照强度下条斑紫菜自由丝状体营养藻丝的叶绿素a含量存在差异，呈现出随光照强度增加先升高再降低的趋势，其中15 μmol·m^-2·s^-1光照强度培养下的藻体叶绿素a含量最高，为2 357.18 μg·g^-1，较75 μmol·m^-2·s^-1组增加32.73%(P < 0.05)。与叶绿素a含量的测定结果不同，类胡萝卜素含量总体上随光照强度增加而逐渐下降，当光照强度增加至75 μmol·m^-2·s^-1时，藻体类胡萝卜素含量最低，为696 μg·g^-1，但各组间藻体类胡萝卜素含量差异不显著(P>0.05)。

比较不同光照强度条件下藻体的藻胆蛋白含量发现，15 μmol·m^-2 ·s^-1光照强度培养下的藻体藻红蛋白含量最高，为43.74 mg·g^-1；60 μmol·m^-2·s^-1组含量最低，为28.78 mg·g^-1(图 4)。藻体的藻蓝蛋白含量随光照强度增强呈现先增加再降低的趋势，藻蓝蛋白含量最低的是75 μmol·m^-2·s^-1组，为1.58 mg·g^-1，约为最高组15 μmol·m^-2·s^-1光照强度培养下的1/2 (P < 0.05)。

2.4 条斑紫菜自由丝状体营养藻丝的PSⅡ最大量子效率F_v/F_m比较

如图 5所示，条斑紫菜自由丝状体营养藻丝F_v/F_m随光照强度增大呈现先升高再降低趋势，15 μmol·m^-2·s^-1光照强度培养下的营养藻丝PSⅡ最大量子效率F_v/F_m最大，约为0.62，显著高于30-75 μmol·m^-2·s^-1组(P<0.05)。75 μmol·m^-2·s^-1组F_v/F_m最小，为0.38，约为15 μmol·m^-2·s^-1组的0.6倍。

3 讨论 3.1 光照强度对条斑紫菜自由丝状体营养藻丝生长及形态的影响

0-15 d，本试验中30-75 μmol·m^-2· s^-1组SGR大于低光照强度试验组(5-15 μmol·m^-2·s^-1)，表明光照强度越大，藻丝生长越快，这与条斑紫菜^[22]、坛紫菜^[23]自由丝状体的研究结果一致。但是随着培养时间的延长，20 d后，5，15 μmol·m^-2·s^-1组SGR明显大于30-60 μmol·m^-2·s^-1组，75 μmol·m^-2·s^-1组SGR出现负值，说明光照强度持续过高，过多的光照会对藻体的生长产生一定的抑制作用^{[24, 25]}。本文SGR与藻体形态观察结果一致: 藻体培养25 d后，5，15 μmol·m^-2·s^-1组藻丝处于正常生长状态；30-60 μmol·m^-2·s^-1组藻丝色泽偏黄，色素体有所降解，膨大细胞比例增加；75 μmol·m^-2·s^-1组藻丝呈中空状，表明光照强度升高到不利于营养藻丝生长的情况下，会刺激藻丝进一步发育成膨大细胞，这与魏家慧等^[16]对条斑紫菜丝状体观察的结果一致。张美如等^[26]、薛学坤等^[27]在紫菜丝状体扩增保种中发现，长时间的过强光照会导致喜光性硅藻、绿藻等杂藻污染的发生。本研究中也发现类似的结果：75 μmol·m^-2·s^-1光照强度下藻丝团外裹着一层硅藻，因此在条斑紫菜丝状体长周期扩大培养中应避免长时间强光培养。综上所述，15 μmol·m^-2·s^-1光照强度适合条斑紫菜自由丝状体营养藻丝的生长，这与骆其君等^[12]研究认为15-60 μmol·m^-2·s^-1光照强度适合其生长的结果不同，其原因可能与开展的试验周期不同有关。

3.2 光照强度对条斑紫菜自由丝状体营养藻丝光合色素含量的影响

叶绿素a是海藻重要的光合色素，藻胆蛋白是红藻的捕光色素蛋白，两者含量的高低与光合作用密切相关^[28]。本研究中，条斑紫菜自由丝状体营养藻丝在15 μmol·m^-2·s^-1光照强度下，藻体叶绿素a、藻红蛋白、藻蓝蛋白含量均表现出较高的水平；当光照强度为30-75 μmol·m^-2·s^-1时，其含量则随光照强度升高而逐渐下降。类胡萝卜素含量在75 μmol·m^-2·s^-1组最低，但与其他各组间差异不显著。对坛紫菜^[23]、条斑紫菜^[29]、龙须菜^[30]、细基江蓠^[31]等海藻的研究已经证实，低光照强度下有利于藻体光合色素的积累，有助于藻体对光能的捕获和传导；而当光照强度过高时，光合作用单元和PSⅡ反应中心数量会减少，藻体的光合色素含量也相应降低。

3.3 光照强度对条斑紫菜自由丝状体营养藻丝F_v/F_m的影响

F_v/F_m值反映PSⅡ反应中心潜在的最大光能转换效率，而PSⅡ在光合作用的光能吸收和转换中起着重要的作用^[32]。本研究中，藻体在15 μmol·m^-2 ·s^-1光照强度下的F_v/F_m值最大，表明该光照强度下藻体的潜在光合作用活性最强。随着光照强度增加，F_v/F_m值显著降低，75 μmol·m^-2·s^-1组F_v/F_m约为15 μmol·m^-2·s^-1组的0.6倍，说明过高的光照强度可以损坏光合作用系统，导致PSⅡ的光能利用效率显著降低。这与野生条斑紫菜^[33]、“黄优1号”条斑紫菜^[16]研究结果相似。本研究中，条斑紫菜自由丝状体营养藻丝的F_v/F_m值为0.38-0.62，低于坛紫菜自由丝状体的0.66-0.74^[23]，说明条斑紫菜自由丝状体光能利用效率及通过PSⅡ的电子传递速率较坛紫菜低，条斑紫菜自由丝状体更偏向低光照强度适应性，这与张涛等^[33]的研究结果一致。因而在调控培养紫菜丝状体扩增时，不同的紫菜物种应采用不同的光照强度。本研究认为，采用15 μmol·m^-2·s^-1的光照强度，更有利于条斑紫菜自由丝状体营养藻丝的生长扩增，达到最优的培养结果。

4 结论

本研究采用单因素分析法，研究光照强度对条斑紫菜自由丝状体营养藻丝生长及生理特性的影响，发现在15 μmol·m^-2·s^-1光照强度下，藻体生长较好且叶绿素a、藻红蛋白、藻蓝蛋白、F_v/F_m值含量最高。因此，建议在条斑紫菜自由丝状体长周期扩增培养中，采用15 μmol·m^-2·s^-1的较低光照强度，更有利于条斑紫菜丝状藻丝的快速生长，达到最优的培养结果。