据估计，真菌大约在16亿年前开始在自然环境中出现[1]，预测自然界中可能存在220万-380万种不同的真菌[2]。其中，大部分真菌对人类是有益的，例如在面粉发酵、酱油制作和霉豆腐生产等过程中都需要真菌的参与。此外，真菌的次级代谢产物也是许多重要药物的主要来源，如青霉素、环孢菌素A和他汀类药物等。然而，少数真菌也能引起动物、植物和人类的多种疾病，对公共卫生、农业和生物多样性产生毁灭性影响[3]。
临床上，目前已知能引起人类疾病的真菌有300余种，其引起的疾病表现多种多样[4]。真菌感染被称为真菌病，根据真菌入侵组织的深浅程度，可以分为浅表真菌病和深部真菌病。浅表真菌病是最常见的皮肤真菌感染病，全球的发病率为20%-25%[5]。在中国，浅表真菌感染主要以红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)为主[6]。深部真菌病也称为侵袭性真菌感染(Invasive Fungal Infections, IFI)，严重时可危及生命。全球每年有超过150万人死于IFI，与肺结核/疟疾的死亡人数相当[7]。曲霉菌、念珠菌和隐球菌是三大机会性病原真菌，是侵袭性真菌感染的主要致病菌。近年来，随着抗生素的滥用、器官移植以及放疗、化疗等的广泛应用，侵袭性真菌感染的发病率呈上升趋势，严重感染的死亡率可达80%以上，尤其是侵袭性曲霉病目前几乎无特效药物可用，已经严重影响人类的生活质量并对生命健康构成威胁[8]。
真菌不仅能够感染人或动物导致真菌病，还能够侵染植物并引发一系列症状，如腐烂、坏死和萎蔫等，从而对植物造成病害。一些常见的植物病害包括锈病、黑粉病、枯萎病、炭疽病和黑穗病等，可造成农作物减产，严重时导致颗粒无收。据统计，全球主要农作物的平均损失占总产量的10%-15%，其中70%-80%的植物病害是由真菌感染引起的[9]。除了对植物造成病害外，植物病原真菌还会产生次生代谢产物，污染农产品，严重影响农产品的质量，对人体健康构成极大威胁，如黄曲霉毒素、镰刀菌毒素和麦角毒素等。
广西位于亚热带地区，与东盟国家相邻，气候温暖潮湿，真菌病原菌的多样性非常显著。各种新发、高发机会性真菌感染层出不穷，且耐药真菌菌株日益增多，已成为威胁广西人民健康的一个重大问题。此外，由真菌造成的作物病害，如甘蔗黑穗病，香蕉枯萎病、炭疽病，以及百香果根腐病等，严重影响广西特色经济作物的种植和农业发展。在这种情况下，对广西的天然资源进行开发，寻找和开发新型抗真菌药物，不仅可以应对当地真菌感染问题，还可以促进农业的可持续发展和保障人民的健康，具有重要的意义。
1 抗真菌药的种类及现状真菌属于真核生物，其胞内分子机器与动植物的相似，因此开发特异的抗真菌药物非常具有挑战性。目前，临床上用于治疗侵袭性真菌感染的抗真菌药物主要分为4类：多烯类(Polyenes)、唑类(Azoles)、棘白菌素类(Echinocandins) 和嘧啶类似物(Pyrimidine analogs)。治疗浅表真菌感染的常用药物包括烯丙胺类(Allylamines)、吗啉类(Morpholine)和氧硼戊环类(Oxaborole)等。这些药物的作用机制及治疗范围各不相同，详见表 1。
| 药物类型 Types of drugs |
代表药物 Representative drugs |
作用机制 Mechanism of action |
治疗范围 Treatment scope |
| Polyenes[10] | Nystatin, Natamycin, Amphotericin B | Binding to ergosterol on fungal cell membranes | Amphotericin B for treating Invasive Fungal Infections (IFI), Nystatin for treating skin, vaginal and esophageal candidiasis and Natamycin for treating fungal keratitis and corneal infections |
| Azoles[11] | Fluconazole, Itraconazole, Voriconazole | Blocking the biosynthesis of ergosterol on the cell membrane, leading to changes in fungal cell membrane permeability, thus inhibiting fungal growth | For treating superficial Candida infections such as oral, esophageal and vagina candidiasis, as well as fungal infections caused by dermatophytes on the skin and infections caused by Aspergillus fumigatus |
| Echinocandins[12] | Caspofungin, Micafungin | Inhibiting the synthesis of β-(1,3)-D-glucan, the integrity of fungal cell wall was destroyed and fungal cells are eventually lysed | For treating fungal infection caused by Candida, Aspergillus, Histoplasma and other pathogenic fungi |
| Pyrimidine analogs | Flucytosine[13] | Inhibiting DNA, RNA, and protein synthesis | For treating mycoses caused by Candida species (except Candida krusi), Cryptococcus species and some dematiaceous fungi |
| Allylamines[14] | Terbinafine, Naftifine | Reversibly inhibiting squalene epoxidase (a key enzyme in ergosterol biosynthesis) | Good activity against Aspergillus, Trichophyton, and other filamentous fungi, and is widely used for treating skin fungal infections |
| Morpholine | Amorolfine[15] | Inhibiting ergosterol synthesis, leading to impaired cell membrane structure and function | Commonly used for the treatment of onychomycosis and skin fungal infections |
| Oxaborole | Tavaborole[16] | Specifically inhibiting leucoyl transfer ribonucleic acid synthase, thereby inhibiting fungal protein synthesis | For treating toenail onychomycosis caused by Trichophytosis rubrum and filariasis, for external use only |
尽管目前有多种抗真菌药可供选择，但它们都存在一定的局限性。例如，一些药物需要较高剂量才能产生疗效，增加了药物副作用的风险；另外一些药物只能减轻症状，需要长期使用才能治疗；还有一些药物可能导致胃肠道不适、肝损害、肾损害或过敏等不良反应。因此，加强抗真菌药物的研发迫在眉睫[17]。然而，更为紧迫的是，近年来已经发现了越来越多的多重耐药菌株，其中包括在美国多个州爆发的超级真菌——耳念珠菌(Candida auris)以及在印度出现的与新型冠状病毒合并感染的耐药毛霉菌(Mucor)[3]，给临床治疗带来了巨大的挑战。为此，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)已推出政策，允许抗真菌感染新药的市场专营权延长5年，并将抗真菌药物列为“孤儿状态”，降低临床试验的限制，以鼓励抗真菌药物的研发[18]。多个国家的科学家呼吁加强病原真菌发病机制、传播途径、耐药机制、药物开发以及治疗方案的相关研究，以提高对真菌感染的预防和治疗能力。同时，也需要加强抗真菌药物的监管和使用，以避免药物滥用和耐药性的加剧。
在农业领域，我国目前化学农药在农药登记中的占比超过91%，而生物农药仅占约9%[19], 说明我国农业生产主要依赖化学农药来进行植物病害防治。然而，长期大量使用化学农药不仅会导致环境污染和农药残留等问题，还会对生物多样性和生态环境造成不良影响。相比之下，生物农药具有低毒、对环境友好等优点，将成为未来农药发展的趋势。针对真菌病害的农用抗生素种类非常有限，目前常用的仅有6类，包括氨基糖苷类(Aminoglycosides)、大环内酯类(Macrolides)、N-糖甙类抗生素(N-glycoside antibiotics)、尿嘧啶核苷类(Uracil nucleotides)、胞嘧啶核苷类(Cytidine-5′-diphosphate disodium)和酰胺类(Amides)等，详见表 2。相对于化学农药，这些农用抗生素具有活性高、来源广、可共用生产设备、对环境污染小且不易富集等特点[19]。因此，为了促进人类社会的绿色可持续发展，亟需研发新型高效、环保的生物农药来替代化学农药。需要注意的是，不同类型的真菌病害对不同的农用抗真菌药具有不同的敏感性，因此在使用农用抗真菌药时需要根据具体的病害情况选择合适的药物和用药方法。
| 药物类型 Types of drugs |
代表药物 Representative drugs |
作用机制 Mechanism of action |
防治对象 Prevention and control targets |
| Aminoglycosides | Kasugamycin[20] | Binding to ribosome small subunit to inhibit protein synthesis | Mainly for controlling rice blast disease (including leaf blast, rice head blast, and panicle blast |
| Jinggangmycin[21] | Inhibiting trehalase activity, inositol biosynthesis, cellulose degrading enzymes and polygalacturonase activity of fungi | Mainly for controlling sheath blight, rice tungro, and corn ear rot diseases | |
| Macrolides | Tetramycin[22] | Inhibition of mycelial growth and spore germination | Broad-spectrum antifungal activity, mainly controlling wheat powdery mildew, Fusarium head blight, corn head smut, anthracnose and other diseases |
| N-glycoside antibiotics | Zhongshengmycin[23] | Inhibiting protein synthesis, hyphal growth, spore germination and spore formation | Mainly for controlling apple ring rot, watermelon wilt and wheat Fusarium head blight diseases |
| Uracil nucleotides | Polyoxin[24] | Interfering with chitin synthesis in fungal cell walls | Mainly for controlling cucumber downy mildew, powdery mildew, Alternaria panax, apple and pear gray leaf spot, and rice sheath blight diseases |
| Blasticidin S[25] | Inhibiting the incorporation of 14C-glutaminase into proteins by pathogenic fungi, thereby inhibiting protein synthesis, or binding to the ribosomal 50S subunit to prevent the peptide chain elongation | Mainly for controlling rice blast | |
| Cytidine-5′-diphosphate disodium | Wuyiencin[26] | Inhibiting protein synthesis, mycelium growth and spore germination; affecting cell membrane permeability, and activating enzymes related to disease resistance in plants | Mainly for controlling powdery mildew, leaf mold, gummosis and other diseases |
| Ningnanmycin | Involved in the establishment of plant disease resistance mechanism and playing an important role in plant defense response[27] | Mainly for controlling stem rot, gummy stem blight, powdery mildew and other diseases | |
| Amides | Gongzhulingmeisu[26] | Inhibiting the germination of chlamydospores of grain smut, inhibiting hyphal elongation | Mainly for controlling sorghum grain mold, sorghum anthracnose, and wheat fusarium crown rot diseases |
2 抗真菌的药物靶标——真菌细胞壁
细胞壁是真菌细胞外一层高度动态、复杂的结构，主要由β-葡聚糖、几丁质、甘露聚糖等多糖及糖蛋白组成，是真菌的“糖衣”。作为真菌的细胞外骨架，细胞壁不仅起着维持细胞形状、保护细胞抵抗外界压力等作用，而且在病原真菌的极性生长、入侵新的生态域、启动宿主免疫反应中也起着重要作用[28]。真菌细胞壁组分的比例不仅因真菌种类不同而有所改变，而且随着真菌不同的生长阶段而不断发生变化[29]。哺乳动物没有细胞壁，植物细胞壁的主要组分是纤维素、半纤维素、淀粉和果胶等。因此，真菌细胞壁的特殊性使其成为开发抗真菌药物的理想靶标。例如，最新的棘白菌素类新型抗真菌药物的靶标就是细胞壁，通过非竞争性抑制真菌β-1,3-D-葡聚糖合成酶，造成细胞壁中β-葡聚糖含量减少，从而破坏细胞壁结构，最终导致菌体裂解、死亡[30]。另外，农用抗生素多抗霉素(Polyoxin)的作用靶标也是细胞壁，通过竞争性抑制真菌细胞壁中几丁质的合成，从而破坏细胞壁，导致菌体死亡[24]。值得注意的是，棘白菌素类抗真菌药物对肝肾功能无明显影响，耐受性好[31]；多抗霉素对植物病原真菌具有很强的活性，而对植物、鱼类及哺乳动物毒性很低[32]。这些都表明靶向细胞壁的抗真菌药物相较于其他类型抗真菌药物具有高效、低毒的特点。
3 细胞壁作为药靶的研究进展真菌细胞壁是高度动态、复杂的细胞器，在真菌的生长发育过程中，细胞壁必须不断重建，包括旧细胞壁的水解，新细胞壁的不断形成及细胞壁锚定蛋白的插入等过程。因此靶向干预细胞壁合成过程的关键酶或重要调控基因可导致细胞壁组分减少、真菌外骨骼被破坏，从而诱发细胞膜破裂造成真菌死亡。
3.1 葡聚糖合成途径作为药靶的研究葡聚糖是真菌细胞壁的重要组成部分之一，位于真菌细胞壁内层，主要由β-1,3-葡聚糖和α-1,3-葡聚糖组成。在真菌细胞壁合成过程中，葡萄糖通过己糖激酶2 (HXK2) 被磷酸化为葡萄糖六磷酸(Glc-6P)，然后被磷酸葡萄糖变位酶(PGM) 转化为葡萄糖一磷酸(Glc-1P)，最终通过焦磷酸化酶(UGP) 的作用转化成UDP-Glc。UDP-Glc作为葡萄糖的活化形式参与葡聚糖的合成。尽管HXK2、PGM和UGP在人类中也有同源基因，但随着基于片段分子的药物发现方法的兴起和发展，开发真菌特异性抑制剂具有很大的可能性，因此HXK2、PGM和UGP都已被列为潜在的药物靶标[33, 34]。UDP-Glc通过β-1,3-葡聚糖合成酶(包括催化亚基Fks1和调控亚基AfRho1) 的催化合成β-1,3-葡聚糖。目前，已经在临床上应用了通过靶向Fks1抑制真菌的药物，例如非竞争性抑制剂棘白菌素(Echinocandins) 及其衍生物，如卡泊芬净(Caspofungin)、阿尼芬净(Anidulafungin) 和米卡芬净(Micafungin)等[35]。AfRho1是Rho GTPase家族的成员之一，也是烟曲霉(Aspergillus fumigatus)生存的必需蛋白，但由于AfRho1与人类同源蛋白具有高度保守性，寻找特异性抑制AfRho1而不抑制其他Rho GTPase蛋白的研究还在进行中[33]。
近年来，针对耐药菌株的出现和棘白菌素衍生物半衰期短等问题，新型棘白菌素的研发已取得实质性进展。其中，雷扎芬净(Rezafungin)和SCY-078(Ibrexafungerp)比较有代表性[36, 37]。雷扎芬净具有更好的溶解性，能够在类似阴道环境的培养基中显著抑制对氟康唑耐药的白色念珠菌(C.albicans)和光滑念珠菌(C.glabrata)的生长，同时具有更好的口服生物利用度和更长的半衰期[38]。SCY-078是一种新型的β-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂，能够抑制真菌细胞壁的合成，并且可以通过口服给药发挥其抗真菌效果[39]。更重要的是，SCY-078对许多Fks1催化亚基突变而导致耐药的菌株仍具有抗真菌效果，这表明其具有更好的抗真菌药代动力学特性和更高的临床价值[40]。最近，Hu等[41]揭示了真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成的分子基础和棘白菌素类抗真菌药物的耐药产生机制。这些发现将在很大程度上加快针对β-1,3-葡聚糖的新型抗真菌药物的开发进程。
3.2 几丁质合成途径作为药靶的研究几丁质是真菌细胞壁的主要骨架组分，能够保持真菌细胞的硬度和稳定性。UDP-GlcNAc是几丁质合成的糖供体，在几丁质合成酶的催化下合成几丁质[42]。在真核细胞中，UDP-GlcNAc的合成从果糖-6-磷酸(Fru-6P) 开始，主要涉及4个酶，分别是葡萄糖胺-6-磷酸(GlcN-6P) 合成酶(GFA1)、GlcN-6P乙酰转移酶(GNA1)、磷酸乙酰葡萄糖胺变位酶(AGM1) 及UDP-GlcNAc焦磷酸化酶(UAP1)[43]。目前已有一系列的研究表明，参与UDP-GlcNAc合成的酶GNA1、AGM、UAP1都是潜在的药物靶标[44-48]。真菌中的几丁质合成酶存在冗余性[49]，使得靶向单个几丁质合成酶的药物开发非常困难。尼可霉素Z (Nikkomycin Z) 是一种UDP-GlcNAc类似物，能够竞争性与几丁质合成酶结合，从而减少真菌几丁质的合成，达到抑制真菌生长的作用[50]。有研究表明，尼可霉素Z对许多深部真菌感染的治疗效果较好，特别是对由二态真菌引起的真菌病，如球孢子菌病(Coccidioidomycosis)、芽生菌病(Blastomycosis) 和组织胞浆菌病(Histoplasmosis) 等[51-54]。遗憾的是，尼可霉素Z在小鼠和人类血液中的半衰期约为两个小时[50]，这严重限制了其在临床上的应用。因此，开发出更加稳定、对几丁质合成酶亲和力更高的UDP-GlcNAc类似物，有助于推进靶向几丁质合成的抗真菌药物的研发。农用抗生素多抗霉素(Polyoxin)也是一种UDP-GlcNAc类似物[55]，作用机制与尼可霉素Z类似。在农业上，多抗霉素对黄瓜霜霉病、白粉病、人参黑斑病等植物真菌病害有较好的防治效果。目前白色念珠菌的几丁质合成酶结构及其与抑制剂尼可霉素Z、多抗霉素共结合的结构已被解析[56]，这将极大地推进靶向几丁质合成酶的新型抗真菌药物的研发。
3.3 糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白[Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Anchored Proteins，GPI-APs] 合成途径作为药靶的研究糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-APs)通过GPI连接将蛋白锚定在细胞膜或细胞壁上，参与许多重要的生物学过程，如细胞分化、细胞凋亡和细胞信号转导等[57]。真菌细胞壁上的GPI-APs参与细胞壁的完整性、生物膜的形成及真菌对宿主的黏附等生物学过程[58]，对真菌的致病力和侵袭性至关重要[59]。GPI生物合成是酵母和曲霉细胞壁生物合成所必需的一个保守而重要的过程[60]。在GPI合成过程中，需要一系列酶的参与，其中最重要的两个酶是Gwt1[61]和Mcd4[62]。Gwt1介导GPI前体的肌醇酰基化修饰。在真菌中Gwt1可被新型抗真菌药物APX001(E1210) 特异性抑制，从而阻断GPI锚定蛋白的合成，然而人的Gwt1同源蛋白PIG-W却不受抑制[63]。目前，APX001A已完成了Ⅰ期临床试验，将启动针对侵袭性曲霉病与侵袭性念珠菌病的Ⅱ期临床项目[64]。此外，两个人工合成的化合物G365和G884也被证明具有抑制Gwt1活性的作用[65]。Gepinacin也是Gwt1的特异性抑制剂，作用机制与APX001A类似。有趣的是，当白色念珠菌暴露于亚致死浓度的Gepinacin下时其菌丝结构会被破坏，同时暴露细胞壁β-葡聚糖，从而刺激巨噬细胞中的促炎细胞因子反应[66]。Mcd4是一种乙醇胺磷酸转移酶，将磷脂酰乙醇胺的EtNP基团转移到GPI前体Man-Man-GlcN-(acyl)PI中的第二个Man基团上，mcd4基因缺失后导致白色念珠菌不能存活[62]。目前通过抑制Mcd4阻断GPI合成的药物有M743和M720等[62]。M743是一种天然产物，可以抑制Mcd4的乙醇胺磷酸转移酶活性[67, 68]。M720是M743的半合成类似物，与M743具有类似的作用[69]。Spt14 (也称为Gpi3)是UDP-糖基转移酶的催化亚基，负责GPI生物合成的第一步反应。最近有研究表明Jawsamycin化合物能够特异性抑制Spt14的活性，具有广谱的抗真菌活性，但是对人Spt14同源蛋白PIG-A却没有抑制效果[70]，这表明Jawsamycin化合物是非常有应用前景的抗真菌化合物。
4 靶向细胞壁的天然产物随机筛选极性生长在真核生物中广泛存在，是丝状真菌生长发育中的必经阶段。极性生长需要确定芽管或分枝出现的位置，然后将形态发生参与分子招募到这些位置进行局部细胞壁的沉积[71]。在极性生长过程中，真菌细胞壁的合成和降解是高度动态的。真菌是否建立极性、极性生长的异常或缺陷都表明细胞壁合成通路受阻[72]，因此极性的建立和形态发育表型可作为从天然产物中筛选细胞壁抑制剂的标志。根据这一特性，已从天然产物中筛选到一系列能够靶向细胞壁的天然产物。
从鱼腥草(Houttuynia cordata)中提取的鱼腥草素钠可以通过干扰β-1,3-葡聚糖的合成和运输来抑制白色念珠菌的生长。此外，鱼腥草素钠与氟康唑联用可以发挥协同作用[73]。从鱼腥草的木质纤维素水解物中获得的植物天然产物Poacic Acid (PA)，能够与β-1,3-葡聚糖结合从而抑制β-1,3-葡聚糖的合成，具有抗真菌活性，可对一系列植物病原真菌和酿酒酵母产生作用[74]。从小檗属(Berberis)植物中分离获得的小檗碱能够破坏细胞壁的完整性，抑制烟曲霉菌丝的生长，具有良好的抗真菌活性[75]。从罗汉松(Podocarpus macrophyllus)中提取的萘内酯E (Nagilactone E) 是一种去甲二萜双内酯，可通过降低β-1,3-葡聚糖合成酶活性导致酿酒酵母菌细胞壁渗漏，也能引起烟曲霉的形态变化[76]。Arthrichitin是从Arthrinium phaeospermum或海洋真菌Hypoxylon oceanicum中分离出来的一种环状肽，在高浓度时能够抑制几丁质合成酶和葡聚糖合成酶的活性，对Candida spp.和Trychophyton spp.具有广谱的抗真菌活性，是一个良好的先导化合物[77]。根赤壳霉素(Radicicol) 是从真菌Monosporium bonorden 中分离得到的一种化合物，能够非竞争性抑制几丁质合成酶的活性，从而干扰细胞壁的合成，对毛霉属真菌具有良好的抗真菌活性[78]。Cyclothiazomycin B1是从链霉菌A307的培养液中分离出来的一种环硫肽[79]，能够与真菌细胞壁几丁质结合从而降低细胞壁硬度，达到抑菌的效果，对毛霉菌、镰刀菌(Fusarium)等丝状真菌均有抑制活性[77]。更重要的是，Cyclothiazomycin B1对哺乳动物细胞系无细胞毒性，因此是一个良好的抗真菌先导化合物[80]。
5 展望近年来，由于抗真菌药物及抗生素的滥用，出现了越来越多的耐药菌株，严重威胁人类健康及农业生产，因此寻找新的药物靶标和开发新型抗真菌药物的工作非常紧迫。
首先，需要加强真菌细胞壁在药物研发领域的基础研究。通过挖掘直接或间接参与真菌细胞壁合成和调控的新基因，评估其作为药物靶点的可开发性。同时，解析靶点与片段分子的结合方式，以评价靶点的药物可行性。建立细胞水平和动物模型上的细胞壁抑制剂高通量筛选平台，鉴定药物靶点和作用机理，为抗真菌药物的开发提供先导化合物。对于出现的耐药菌株，可以通过改进现有药物的结构来生成更安全有效的抗真菌药物。
其次，需要加强微生物来源的天然产物在抗真菌中的应用研究。微生物来源的天然化合物是抗真菌药物的重要来源之一。广西拥有特殊的生境，如天坑、地下溶洞和喀斯特石山等，其中蕴藏着丰富的、未被挖掘的微生物资源。因此，应充分挖掘这些特殊生境的微生物资源，用于真菌病和真菌病害的防控。
再次，应加强中草药方剂在抗真菌中的应用。随着耐药菌株的增多，现有抗真菌药物的治疗效果逐渐下降，而新型抗真菌药物的研发周期长、成本高。因此，迫切需要寻找新的方法治疗真菌感染。中医药作为中华民族的瑰宝，历经千年而不衰，早就具备了抗真菌的方剂。广西作为一个少数民族聚居的地区，拥有丰富的中药资源，如壮药、瑶药和苗药等。因此，应加强中药方剂在体外和体内抗真菌活性的研究，同时探索将中药活性成分与现有抗真菌药物联合使用的协同效应，充分发挥中药在真菌感染中的作用。
最后，还需加强真菌病菌的监测和病原菌的分离鉴定，加强公众的健康教育和科普宣传，提高人民对真菌病的防控意识，从源头上减少真菌感染，以更好地保障人民的健康和生命安全。
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