2. 广西农业工程职业技术学院食品工程学院, 广西南宁 532100;
3. 广西壮族自治区水产科学研究院, 广西壮族自治区优势特色水产品加工与贮藏工程研究中心, 广西南宁 530021
2. College of Food Engineering, Guangxi Agricultural Engineering Vocational Technical College, Nanning, Guangxi, 532100, China;
3. Guangxi Engineering Research Center of Processing & Storage of Aquatic Products, Guangxi Academy of Fishery Science, Nanning, Guangxi, 530021, China
杂环芳香胺(Heterocyclic Aromatic Amines, HAAs)是在富含蛋白质的食品(如肉类和鱼类等)高温加工过程中形成的一类具有强致突变性和致癌性的芳香族化合物[1]。杂环芳香胺2-氨基-3, 8-二甲基咪唑并[4, 5-f]喹喔啉(MeIQx)是2B类致癌HAAs，美国国家癌症研究协会在1 000份人胃癌样本中检测发现有35.8%的样本含有MeIQx[2]。过量摄入含有MeIQx的食物会增加人体内的氧化应激水平，使细胞的生物活性功能受损，进而损害人体健康[3]。因此，食源性MeIQx的安全问题受到社会广泛关注。
MeIQx是由前体物葡萄糖与氨基酸(甘氨酸、苏氨酸)发生美拉德反应和Strecker降解后，降解物经Amadori重排等一系列复杂化学反应形成吡嗪类、吡啶类化合物，再通过Aldol缩合机制与肌酐反应形成[3-4]。研究表明，以甘氨酸、葡萄糖、肌酐为核心前体物的MeIQx模拟体系可成功生成MeIQx，但生成量较少，为提升MeIQx产量，往往需通过重复循环反应操作或大幅增加前体物投加量的方式进行优化，导致成本增加[5]。富含蛋白质食品在高温加工过程中产生的氧化产物，如乙二醛(GO)、氧化三酰甘油酯单体、共轭亚油酸等，是生成MeIQx的关键促进因子[6-7]。有研究表明，将氧化产物用于构建MeIQx模拟体系可显著促进MeIQx的形成[7-8]，这为解决现有MeIQx模拟体系MeIQx生成量不足且成本高的难题提供了思路。
活性羰基化合物(RCC)可通过Strecker降解将苯丙氨酸转化为苯乙醛，从而促进2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4, 5-b]吡啶(PhIP)的形成[9-10]。尽管GO、氧化三酰甘油酯单体、共轭亚油酸等脂质氧化产物影响MeIQx的生成[5]，但是2-甲基丙烯醛作为一种高活性RCC，是食品热加工过程中脂质氧化的重要特征产物，其对MeIQx形成的影响尚不明确。有研究称，RCC的活性羰基可与氨基酸的氨基、肌酐、HAAs，以及美拉德反应和Strecker降解过程中产生的某些中间体的亲核基团发生反应[11-13]。本研究推测RCC对MeIQx形成的影响可能源于双重作用：一方面促进氨基酸的Strecker降解，为MeIQx合成提供关键前体；另一方面可与MeIQx及其前体或中间体发生分子间反应，阻断或改变其生成路径。这为阐明2-甲基丙烯醛对MeIQx形成的作用提供了方法。本研究旨在通过构建含甘氨酸、肌酐和葡萄糖的MeIQx生成化学模型，系统探讨2-甲基丙烯醛对MeIQx形成的影响，并分析其对前体物质及关键中间体的作用机制，测定不同氧化时间罗非鱼鱼糜的MeIQx含量变化，评估脂质氧化进程对鱼糜中MeIQx生成的影响。
1 材料与方法 1.1 材料MeIQx、葡萄糖、甘氨酸由广西小研人生物科技有限公司提供，肌酐、2-甲基丙烯醛购自生工生物工程(上海)股份有限公司，O-(2, 3, 4, 5, 6-五氟苄基)羟胺盐酸盐(PFBHA)、甲醇和乙腈(色谱级)购自上海麦克林生化科技股份有限公司。其他分析级溶剂购自上海安谱实验科技股份有限公司。聚醚砜(PES)膜、螺口密封厚壁耐压管购自洛科精密机械(上海)有限公司。Acquity BEH C18柱购自美国Waters公司。
配置三重四极杆质谱仪的Acquity UPLC系统的超高效液相色谱-质谱联用仪(UHPLC-MS，美国Waters公司)，配置2414型示差折光检测器(RID)和Ultimate XB-NH2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)的Waters e2695高效液相色谱仪(HPLC，美国Waters公司)，气相色谱-质谱联用仪(GC-MS，美国Agilent公司)，UV-2300紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)，Milli-Q超纯水仪[洛科精密机械(上海)有限公司]。
1.2 2-甲基丙烯醛对化学模型中MeIQx形成的影响参考Zhu等[5]的方法构建化学模型，将甘氨酸(80 mmol)、肌酐(80 mmol)和葡萄糖(40 mmol)溶于5 mL蒸馏水中，转移至螺口密封厚壁耐压管中。预实验表明，MeIQx生成量在2-甲基丙烯醛浓度为0.02-0.20 mmol/L时呈非线性变化，0.04 mmol/L时达峰值；0.04-0.20 mmol/L间无显著差异，故跳过中间浓度(如0.08 mmol/L)；高浓度(0.40、0.80 mmol/L)用于验证前体物质竞争性消耗及产物降解效应。因此，分别添加2-甲基丙烯醛溶液使其最终浓度梯度为0、0.02、0.04、0.20、0.40、0.80 mmol/L。将混合物于130 ℃硅油浴中加热2 h，反应结束后将样品冷却至室温，取3 mL反应液加入等体积乙酸乙酯进行液液萃取，涡旋混合5 min后超声处理15 min以提高萃取效率，随后4 000 g下离心10 min，收集乙酸乙酯相。重复上述萃取步骤3次，合并提取液，将合并后的有机相在40 ℃下减压旋转蒸发至近干，残留物用1 mL甲醇复溶，超声分散后经0.22 μm尼龙滤膜过滤，滤液备用。
参照Scheijen等[9]的方法，色谱分离在Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)上进行。流动相由甲醇(溶剂A)和0.1%甲酸水溶液(溶剂B)组成。梯度洗脱程序如下：0.0 min，90% B；1.0 min，90% B；4.0 min，0% B；5.0 min，0% B；5.1 min，10% B；6.0 min，90% B；8.0 min，90% B；注射体积为2 μL，流速0.35 mL/min。质谱分析采用正电喷雾电离模式，主要参数设置如下：脱溶温度350 ℃，毛细管电压3.5 kV，碰撞能量20 eV。采用多重反应模式进行监测，使用m/z 131.1-213.9作为定性离子，m/z 199.2-213.9作为定量离子检测MeIQx。通过对比标准品的保留时间和质谱特征碎片对MeIQx进行定性鉴定分析。定量分析采用外标法，建立7个浓度梯度(0-100 ng/mL)的标准曲线，相关系数(R2)达到0.999 5。MeIQx的检测限(LOD，S/N=3)为0.09 ng/mL，定量限(LOQ，S/N=10)为0.25 ng/mL。通过加标回收实验评估方法的准确度与精密度：向空白样品中添加已知浓度的MeIQx标准品，平行测定3次，计算平均回收率与相对标准偏差(RSD)。回收率计算公式如下：回收率(%) = [(标准曲线计算值)-(原始量)]/添加量×100%。
1.3 2-甲基丙烯醛对MeIQx前体和中间体含量的影响 1.3.1 甘氨酸、肌酐及葡萄糖的HPLC分析对上述反应混合物进行前处理和分析，将反应混合物用超纯水稀释10倍后，经0.22 μm的PES膜过滤，参照已报道的方法[7-8]采用HPLC对甘氨酸、肌酐和葡萄糖进行定量分析。采用HPLC检测甘氨酸和肌酐，色谱分离采用YMC-Pack ODS C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相由甲醇(溶剂A)和0.1%甲酸水溶液(溶剂B)组成，采用等度洗脱程序(1 mL/min，90% B，0-15 min)。光电二极管阵列检测器(Photodiode Array Detector, PDA)波长分别设置为210、215 nm，用于甘氨酸和肌酐检测。通过对比标准品的保留时间对目标物进行定性分析。定量分析采用外标法，分别建立甘氨酸和肌酐的7点校准曲线(0-2 000 μg/mL)，甘氨酸和肌酐校准曲线的R2分别为0.999 8、0.999 7。甘氨酸的LOD和LOQ分别为0.30、0.99 μg/mL，肌酐分别为0.39、1.30 μg/mL。甘氨酸的平均回收率为87.3%，RSD为3.8%；肌酐的平均回收率为88.6%，RSD为3.4%。
采用HPLC定量分析葡萄糖，柱温恒定维持在(35±0.5) ℃，流动相为超纯水与乙腈的混合溶液(25∶75，V∶V)，流速为1 mL/min，通过对比标准品的保留时间定性鉴定葡萄糖。定量分析采用外标法，建立7个浓度梯度(0-2 000 μg/mL)的校准曲线。葡萄糖标准曲线的R2为0.999 1，表明其线性关系良好，葡萄糖的LOD和LOQ分别为53、162 μg/mL，平均回收率和RSD分别为84.3%和4.6%。
1.3.2 GO与甲基乙二醛(MGO)的UHPLC-MS分析采用UHPLC-MS测定MeIQx生成化学模型中GO及MGO的含量。移取上述实验中的MeIQx反应液200 μL，与等体积5 mmol邻苯二胺衍生化试剂充分混合，室温避光静置12 h[9]。取100 μL衍生化混合液，用超纯水稀释至1 mL，超声处理并过0.22 μm PES膜过滤，UHPLC-MS分析条件与MeIQx检测条件保持一致。质谱检测采用多反应监测模式(MRM)，其中GO衍生物选择m/z 104.1-131.0作为定性离子，m/z 77.0-131.0作为定量离子；MGO衍生物选择m/z 118.0-145.0作为定性离子，m/z 77.0-145.0作为定量离子。定量分析采用外标法，分别建立GO和MGO的7点校准曲线(0-200 ng/mL)，GO和MGO标准曲线的R2分别为0.999 6和0.999 5。GO和MGO的LOD分别为2.78、0.87 ng/mL，LOQ分别为8.99、3.15 ng/mL，平均回收率分别为82.1%和80.1%，RSD分别为3.2%和2.2%。
1.3.3 其他挥发性中间体的SPME-GC-MS分析采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)技术测定MeIQx生成化学模型中的挥发性中间体[13]并稍作调整。将3 mL 0.5 mg/mL的PFBHA水溶液加入25 mL琥珀色特氟龙顶空瓶中，并投入1 cm磁力搅拌子。将涂覆65 μm厚度的聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)涂层的SPME纤维置于液面上方1 cm处，在50 ℃顶空吸附PFBHA 10 min。完成吸附后，将SPME纤维转移至含2 mL MeIQx反应液及20 μL内标物2, 4, 6-三甲基吡啶(1 μg/mL)的样品瓶中，相同条件下进行30 min的醛类衍生化反应，期间维持600 g恒速搅拌PFBHA与反应混合物。
GC-MS采用无分流进样模式，将SPME纤维在250 ℃下脱附5 min，色谱分离在HP-5 MS 5%苯基甲基硅氧烷柱(30 mm×250 μm，0.25 μm)上进行，载气为高纯氦气(1 mL/min)。操作条件如下：柱温程序为40 ℃(2 min)；以5 ℃/min升至90 ℃，90 ℃(3 min)；以10 ℃/min升至250 ℃，250 ℃(3 min)；以5 ℃/min升至260 ℃，260 ℃(2 min)；进样温度为250 ℃。质谱检测条件如下：扫描范围25-450 m/z，电离模式为电子电离，离子源温度为280 ℃，电离电压为70 eV。通过与标准品的保留时间和特征质谱图比对定性分析，使用已知浓度的标准混合物与恒定水平的内标物形成的校准曲线来定量醛类化合物。将标准品添加到反应混合物中，并经过正常的样品制备程序，配制7个浓度梯度(0-200 ng/mL)的标准溶液，向各标准溶液中加入10 ng/mL内标物，绘制目标物与内标物的峰面积比-浓度校准曲线，基于目标物与内标物的峰面积比进行定量计算。
1.4 2-甲基丙烯醛对丙烯醛-甘氨酸和丙烯醛-肌酐模型中甘氨酸和肌酐含量的影响准确称取甘氨酸(0.4 mmol)或肌酐(0.4 mmol)与梯度浓度的2-甲基丙烯醛(0、0.02、0.04、0.20、0.40、0.80 mmol/L)在5 mL蒸馏水中混合，转移至带螺旋盖的厚壁压力管中。将混合物于130 ℃下加热2 h。反应结束后，将样品冷却至室温，用超纯水稀释10倍，采用HPLC-PDA进一步分析，定量测定丙烯醛-甘氨酸和丙烯醛-肌酐模型中甘氨酸和肌酐的含量。HPLC-PDA的条件与1.3.1节所述条件保持一致。
1.5 2-甲基丙烯醛对丙烯醛-MeIQx模型中MeIQx含量的影响将MeIQx(0.05 mmol/L)与梯度浓度的2-甲基丙烯醛(0、0.02、0.04、0.20、0.40、0.80 mmol/L)混合在5 mL的蒸馏水中。混合物在130 ℃下加热2 h后，经0.22 μm的尼龙膜过滤，采用UHPLC-MS分析定量测定MeIQx的含量。UHPLC-MS分析条件与1.2节所述条件保持一致。
1.6 罗非鱼鱼糜的氧化 1.6.1 硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)分析将罗非鱼鱼糜置于4 ℃冰箱中保存0、2、4、6、8、10 d。通过测量TBARS值来监测脂质氧化情况[14]。具体方法如下：准确称取2.0 g罗非鱼鱼糜样品，加入25 mL 5%的三氯乙酸(TCA)溶液提取5 min。将混合物在4 000 g下离心15 min，收集上清液备用。取5 mL的上清液与5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液混合，100 ℃加热60 min。冷却至室温后，使用紫外分光光度计于532 nm处测量吸光度，以1, 1, 3, 3-四乙氧基丙烷作为标准品，建立0-0.2 μg/mL的校准曲线(y=0.8927x + 0.0168，R2 =0.996 5)，按下式计算TBARS值：
| $ \text { TBARS 值 }(\mathrm{mg} \text { MDA } / \mathrm{kg} \text { 肉 })=(c \times V) / m \text {, } $ |
其中，c代表从标准曲线获得的提取物中丙二醛(MDA)的浓度(μg/mL)，V代表用于提取的TCA溶液的体积(mL)，m代表样品的质量(g)。
1.6.2 罗非鱼鱼糜中的醛类化合物的SPME-GC-MS分析通过SPME-GC-MS测定在4 ℃下保存不同时间的罗非鱼鱼糜中醛类化合物含量，根据已报道的方法[15]进行修改。操作步骤：准确称取2.5 g罗非鱼鱼糜加入2.5 mL氯化钠(0.18 g/mL)中，将样品涡旋振荡3 min。SPME-GC-MS分析条件与1.3.3节所述条件保持一致。
1.6.3 烤罗非鱼鱼糜中MeIQx的UHPLC-MS分析基于先前研究制备罗非鱼鱼糜[16]。取10 g罗非鱼鱼糜，在玻璃培养皿(直径4 cm，高0.4 cm)塑形成圆盘状，在预热至230 ℃的烤箱中每面烘烤5 min，将罗非鱼鱼糜与20 mL的1 mol/L氢氧化钠混合，充分搅拌3 min形成浓稠的糊状物，加入20 mL正己烷并剧烈搅拌，4 000 g离心8 min进行脱脂，弃去上层正己烷。参照1.2节的提取方法, 调整20 mL乙酸乙酯用量，提取罗非鱼鱼糜中的MeIQx。采用与1.2节所述的色谱-质谱条件定性定量分析MeIQx。
1.7 统计分析所有测试样本均进行3次重复实验和分析。结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析，图表使用Origin 2024绘制。P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 2-甲基丙烯醛对化学模型中MeIQx形成的影响不同浓度2-甲基丙烯醛对MeIQx形成的影响如图 1所示。2-甲基丙烯醛的添加浓度对MeIQx的生成具有显著影响(P < 0.05)，当2-甲基丙烯醛浓度为0.02-0.20 mmol/L时，MeIQx的生成量显著增加。与对照组相比，当向化学模型中添加0.02、0.04、0.20 mmol/L的2-甲基丙烯醛时，MeIQx的含量分别增加36.67%、69.48%、24.23%。然而，当2-甲基丙烯醛浓度达到0.40 mmol/L时，其对MeIQx的形成没有显著影响。而添加0.80 mmol/L的2-甲基丙烯醛时，其显著抑制了MeIQx的生成，化学模型中产生的MeIQx减少了54.37%。表明添加低浓度(≤0.20 mmol/L)的2-甲基丙烯醛可促进MeIQx形成，而添加高浓度(>0.20 mmol/L)的2-甲基丙烯醛对MeIQx的形成产生抑制作用。
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| Different lowercase letters indicate significant differences among groups (P < 0.05). 图 1 2-甲基丙烯醛浓度对化学模型中MeIQx形成的影响 Fig.1 Effect of 2-methyl acrolein concentration on the formation of MeIQx in the chemical model |
2.2 2-甲基丙烯醛对MeIQx前体和中间体含量的影响
2-甲基丙烯醛对MeIQx前体和中间体含量的影响如图 2所示，添加2-甲基丙烯醛可减少化学模型中甘氨酸和肌酐的含量，提高葡萄糖的水平。对挥发性中间体的分析结果如表 1所示，2-甲基丙烯醛对MeIQx形成中间体的影响呈现浓度依赖性。检测到的GO、MGO、2, 5-二甲基吡嗪都是MeIQx的中间体，在0.02-0.20 mmol/L的范围内，随着2-甲基丙烯醛浓度的增加，GO、2, 5-二甲基吡嗪和MGO的含量均相对于对照组有所增加，当2-甲基丙烯醛的浓度为0.40-0.80 mmol/L时，三者含量呈下降的趋势。MeIQx的中间体和总醛含量都随着2-甲基丙烯醛浓度增加呈现先增加后下降的趋势。这些结果表明，在0-0.20 mmol/L的范围内，2-甲基丙烯醛可以促进Strecker降解甘氨酸，进而生成更多挥发性中间体。
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| Different lowercase letters indicate significant differences among groups (P < 0.05). 图 2 2-甲基丙烯醛浓度对化学模型中甘氨酸、肌酐和葡萄糖的影响 Fig.2 Effect of 2-methyl acrolein concentration on glycine, creatinine and glucose in the chemical model |
| 2-甲基丙烯醛浓度/ (mmol/L) Concentration of 2-methyl acrolein/ (mmol/L) |
中间体/(ng/mL) Intermediate/(ng/mL) |
中间体调控类物质/(ng/mL) Regulatory substance of intermediate/(ng/mL) |
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| 2, 5-二甲基吡嗪 2, 5-dinethylpyrazine |
甲基乙二醛 MGO |
乙二醛 GO |
甲醛 Formaldehyde |
乙醛 Acetaldehyde |
丙二醛 Malonaldehyde |
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| 0 | 1.13±0.06b | 115.21±1.40c | 72.50±12.43b | 32.01±1.25c | 56.48±1.08e | 12.10±0.34b | |
| 0.02 | 1.26±0.15ab | 139.86±5.99b | 88.97±4.82a | 37.86±0.53b | 60.96±1.81d | 12.86±0.17ab | |
| 0.04 | 1.42±0.20a | 156.12±0.85a | 95.12±6.06a | 42.89±1.43a | 66.80±0.72c | 13.29±0.10ab | |
| 0.20 | 1.16±0.02b | 118.58±1.59c | 73.98±10.86b | 36.07±0.51b | 63.14±0.98d | 13.48±0.98ab | |
| 0.40 | 1.09±0.06b | 90.16±6.41d | 58.12±9.58b | 27.10±2.59d | 69.36±2.89b | 14.96±2.88ab | |
| 0.80 | 0.75±0.12c | 39.83±3.58e | 27.10±9.36c | 18.98±3.59e | 82.29±2.02a | 18.39±6.30a | |
| 2-甲基丙烯醛浓度/(mmol/L) Concentration of 2-methyl acrolein/(mmol/L) |
中间体调控类物质/(ng/mL) Regulatory substance of intermediate/(ng/mL) |
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| 丁醛 Butylaldehyde |
戊醛 Valeraldehyde |
己醛 Hexanal |
庚醛 Heptanal |
||||
| 0 | 0.88±0.10a | 0.58±0.12a | 5.50±1.60a | 0.72±0.30c | |||
| 0.02 | 1.10±0.34a | 0.72±0.08a | 6.99±1.62ab | 0.86±0.27c | |||
| 0.04 | 1.18±0.35a | 0.76±0.10a | 8.36±1.21a | 1.01±0.33c | |||
| 0.20 | 1.25±0.02a | 0.72±0.01a | 8.36±0.70a | 1.09±0.28c | |||
| 0.40 | 1.32±0.35a | 0.78±0.08a | 8.53±1.15a | 1.60±0.15b | |||
| 0.80 | 1.36±0.40a | 0.77±0.18a | 8.40±1.88a | 2.43±0.16a | |||
| 2-甲基丙烯醛浓度/(mmol/L) Concentration of 2-methyl acrolein/(mmol/L) |
中间体调控类物质/(ng/mL) Regulatory substance of intermediate/(ng/mL) |
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| 2-糠醛 2-furaldehyde |
反式-2-戊醛 Trans-2-pentaldehyde |
丙酮 Acetone |
1, 3-二羟基丙酮 1, 3-dihydroxyacetone |
2-丁酮 2-butanone |
总醛 Total aldehydes |
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| 0 | 0.52±0.02a | 0.26±0.01ab | 13.98±0.73bc | 10.76±0.80ab | 1.24±0.29a | 323.87±10.09d | |
| 0.02 | 0.56±0.03a | 0.30±0.04a | 14.29±0.34b | 12.39±1.04a | 1.21±0.11a | 380.01±10.16b | |
| 0.04 | 0.68±0.04a | 0.30±0.03a | 15.39±0.28a | 12.48±0.22a | 1.34±0.09a | 417.14±6.88a | |
| 0.20 | 0.66±0.08a | 0.24±0.02b | 13.79±0.39bc | 11.01±1.08ab | 1.03±0.18ab | 344.56±9.11c | |
| 0.40 | 0.69±0.17a | 0.22±0.01b | 13.16±0.38c | 9.06±2.01bc | 0.82±0.11b | 297.03±4.66e | |
| 0.80 | 0.86±0.37a | 0.12±0.02c | 10.52±0.22d | 7.31±1.42c | 0.55±0.11c | 219.66±10.85f | |
| Note：different lowercase letters represent significant differences (P < 0.05). | |||||||
2.3 2-甲基丙烯醛对甘氨酸和肌酐含量的影响
2-甲基丙烯醛对甘氨酸和肌酐含量的影响如图 3所示，在两种模型中，随着2-甲基丙烯醛浓度的增加，甘氨酸和肌酐含量均显著降低，新生成化合物的含量均相应显著增加，呈现明显的2-甲基丙烯醛浓度依赖性。表明2-甲基丙烯醛可以作为MeIQx的关键前体与甘氨酸和肌酐发生反应，导致MeIQx在高浓度2-甲基丙烯醛(>0.2 mmol/L)下降解，产生新的化合物。
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| Different lowercase letters indicate significant differences among groups (P < 0.05). 图 3 2-甲基丙烯醛对丙烯醛-甘氨酸和丙烯醛-肌酐模型中甘氨酸和肌酐含量的影响 Fig.3 Effect of 2-methyl acrolein on glycine and creatinine contents in acrolein-glycine and acrolein-creatinine models |
2.4 2-甲基丙烯醛对MeIQx含量的影响
2-甲基丙烯醛对MeIQx含量的影响如图 4所示，在丙烯醛-MeIQx模型中，随着2-甲基丙烯醛浓度的增加，MeIQx含量显著降低。与0 mmol/L浓度相比，添加0.80 mmol/L的2-甲基丙烯醛可以使模型中MeIQx的含量降低98.02%。表明2-甲基丙烯醛可能通过去除最终产物MeIQx来限制系统内MeIQx的形成。
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| Different lowercase letters indicate significant differences among groups (P < 0.05). 图 4 2-甲基丙烯醛对丙烯醛-MeIQx模型中MeIQx含量的影响 Fig.4 Effect of 2-methyl acrolein on the content of MeIQx in the acrolein-MeIQx model |
2.5 脂质氧化对罗非鱼鱼糜中MeIQx形成的影响
脂质氧化对罗非鱼鱼糜MeIQx形成的影响如表 2所示。结果显示，0-4 d，除乙醛外，其他醛类的浓度随着氧化时间的延长而增加，且除乙醛和异戊醛外，其他醛类均在第4天达到最大值，在罗非鱼鱼糜中检测到10种醛类物质，其中丙醛、丙酮、己醛、丙烯醛为主要氧化产物。氧化时间对罗非鱼鱼糜的TBARS和MeIQx形成影响如图 5所示，TBARS值随着氧化时间的增加而增加，当鱼糜样品氧化4 d时，TBARS从(0.44±0.06) mg MDA/kg增加到(1.70±0.10) mg MDA/kg，相应的MeIQx随着氧化时间的增加而增加，在第4天增加了211.81%。当氧化时间继续延长至10 d时，尽管TBARS值继续增加至(4.0±0.12) mg MDA/kg，但MeIQx的含量却呈现下降趋势。以上结果表明氧化程度影响MeIQx的形成。
| 氧化时间/d Oxidation time/d |
甲醛 Formaldehyde |
乙醛 Acetaldehyde |
丙酮 Acetone |
丙烯醛 Acrolein |
丙醛 Propionaldehyde |
|
| 0 | 0.48±0.03b | 2.50±0.35c | 10.69±0.96d | 6.52±1.62d | 12.88±3.79d | |
| 2 | 0.50±0.04b | 3.62±0.56bc | 13.68±1.99d | 23.10±0.79b | 42.69±2.66b | |
| 4 | 1.72±0.50a | 3.32±0.08bc | 48.11±5.50a | 37.26±4.20a | 70.86±11.01a | |
| 6 | 1.43±0.32a | 4.41±0.21b | 25.69±1.43b | 15.96±3.30c | 46.99±1.80b | |
| 8 | 0.42±0.10b | 4.29±0.99b | 20.01±2.26c | 25.79±0.90b | 30.16±6.36c | |
| 10 | 0.53±0.03b | 8.66±0.87a | 13.40±0.75d | 15.58±3.72c | 26.18±8.80c | |
| 氧化时间/d Oxidation time/d |
丁醛 Butyraldehyde |
巴豆醛 Crotonaldehyde |
异戊醛 Isovaleraldehyde |
戊醛 Valeraldehyde |
己醛 Hexanal |
总醛 Total aldehydes |
| 0 | 0.66±0.27e | 0.57±0.08f | 1.53±0.69c | 1.79±0.22e | 15.87±1.63d | 53.49±6.09c |
| 2 | 4.66±0.40c | 4.31±0.31c | 2.67±0.04c | 9.39±0.81b | 26.78±5.16bc | 131.40±9.01b |
| 4 | 8.11±0.30a | 7.26±0.48a | 2.90±0.29c | 14.16±1.08a | 36.06±4.09a | 229.76±26.09a |
| 6 | 6.10±0.48b | 5.46±0.49b | 3.61±0.56c | 9.72±1.12b | 24.79±3.24c | 144.16±11.19b |
| 8 | 4.25±0.88c | 2.89±0.62d | 13.41±1.76b | 7.16±0.44c | 29.69±3.60b | 138.07±12.96b |
| 10 | 2.64±0.12d | 1.65±0.22e | 16.48±7.28a | 4.26±0.53d | 16.69±1.25d | 116.07±21.46b |
| Note：values are mean±SD (n=3).Means in a row with different lowercase letters differ significantly (P < 0.05). | ||||||
|
| Different lowercase letters indicate significant differences among groups (P < 0.05). 图 5 氧化时间对罗非鱼鱼糜TBARS和MeIQx的影响 Fig.5 Effect of oxidation time on the formation of TBARS and MeIQx in tilapia surimi |
3 讨论
本研究通过构建MeIQx生成化学模型，系统探究不同浓度2-甲基丙烯醛对MeIQx形成的影响。结果表明(图 1)，低到中等浓度(0.02-0.20 mmol/L)2-甲基丙烯醛对MeIQx的生成有显著影响，当2-甲基丙烯醛浓度升高至0.40 mmol/L时，其对MeIQx形成的影响不再显著；而当浓度进一步提升至0.80 mmol/L时，2-甲基丙烯醛可显著抑制MeIQx的生成。本研究结果与先前关于脂质氧化衍生物影响PhIP形成的研究结果[4]存在差异。在PhIP形成研究中，初级、次级和三级碳基团氧化产物均被发现能显著促进PhIP的生成，这种差异可能源于本研究采用了更广泛的2-甲基丙烯醛浓度范围，而先前研究仅针对单一脂质氧化产物进行了测试[5-6]。
美拉德反应和Strecker降解在甘氨酸、葡萄糖和气态化合物(如GO、MGO和2, 5-二甲基吡嗪)的形成中存在联系，这些化合物被认为是参与MeIQx形成的重要中间体[17]。本研究发现，添加2-甲基丙烯醛可减少化学模型中甘氨酸和肌酐的含量，同时增加葡萄糖的含量。这一现象表明2-甲基丙烯醛可能与葡萄糖竞争参与Strecker降解，促进甘氨酸的转化[18]。此外，本研究也发现，2-甲基丙烯醛对MeIQx形成中间体的影响呈现浓度依赖性，MeIQx的中间体和总醛含量与图 1的结果存在相似的变化规律，在0-0.20 mmol/L的范围内，2-甲基丙烯醛可以促进Strecker降解甘氨酸生成更多挥发性中间体，随后这些共同生成的中间体凝结成更多的肌酐，进一步缩合形成MeIQx。当2-甲基丙烯醛的浓度超过0.20 mmol/L时，过量的2-甲基丙烯醛不仅与甘氨酸反应，还与肌酐和MeIQx发生竞争性反应，导致前体物消耗增加及产物降解。这可能是由电子供体羰基基团浓度降低，无法有效与甘氨酸、肌酐和MeIQx的亲核氨基基团发生反应所致[19]。
本研究发现(图 3)，在丙烯醛-甘氨酸模型中，随着2-甲基丙烯醛浓度的增加，甘氨酸含量显著降低，新生成化合物的含量相应增加，呈现明显的2-甲基丙烯醛浓度依赖性。据报道，MGO可通过反应消除甘氨酸、血清和苯丙氨酸，该反应发生在MGO的羰基基团和这些氨基酸的氨基基团之间[20]。基于此，推测新生成化合物可能是MGO与甘氨酸反应的产物。有研究表明，MGO可以与肌酐反应形成MGO-肌酐模型中的化合物[21]。因此，肌酐可能通过MGO和肌酐之间相同的反应方式与2-甲基丙烯醛反应形成新化合物，其形成过程可能如下：随着2-甲基丙烯醛的添加，肌酐含量在丙烯醛-肌酐模型中呈浓度依赖性降低，且新化合物也随之增加，但相应的形成机制还需要进一步研究[22]。总之，2-甲基丙烯醛可以作为MeIQx的关键前体与甘氨酸和肌酐反应。MGO的羰基基团可与MeIQx的氨基基团反应形成稳定的化合物[23]。本研究发现(图 4)，2-甲基丙烯醛可能通过去除最终产物MeIQx来限制系统内MeIQx的形成。在低到中等浓度(0.02-0.20 mmol/L)下，2-甲基丙烯醛可促进MeIQx的形成，而高浓度(>0.2 mmol/L)下，尽管2-甲基丙烯醛仍具有一定的促进Strecker降解的能力，但因其与甘氨酸、肌酐及MeIQx的反应能力显著增强，一方面导致MeIQx合成所需的前体物过度消耗，另一方面引发已生成的MeIQx发生降解，双重作用叠加后，最终表现为对MeIQx形成的显著抑制效应。
罗非鱼鱼糜含有高水平的多不饱和脂肪酸，这些脂肪酸极易氧化[24]。本研究在罗非鱼鱼糜中检测到10种醛类物质，这与之前报道的罗非鱼鱼糜含有醛类种类一致[25]。另外，本研究发现，轻度至中度氧化的罗非鱼鱼糜能够促进MeIQx的形成，高度氧化的罗非鱼鱼糜不会促进MeIQx的形成。通过不同的方法，如低温储存、真空包装、改良气氛包装和添加抗氧化剂，控制和最小化肉类、鱼类在运输和储存过程中的脂质氧化[19]，可能是有效抑制热加工肉类和鱼类产品中HAA形成的有效方法。
4 结论本研究通过化学模型及罗非鱼鱼糜探究了脂质氧化产物2-甲基丙烯醛对杂环芳香胺MeIQx形成的影响。结果表明，低到中等浓度的2-甲基丙烯醛(0.02-0.20 mmol/L)通过促进甘氨酸的Strecker降解和挥发性中间体(如GO、MGO及2, 5-二甲基吡嗪)的生成，显著提高MeIQx的产量；而高浓度的2-甲基丙烯醛(> 0.2 mmol/L)则因与甘氨酸、肌酐及MeIQx发生反应，导致前体消耗及产物降解，从而抑制MeIQx的形成。进一步分析表明，2-甲基丙烯醛的羰基可与甘氨酸和肌酐的氨基结合，生成新的化合物，且该反应呈浓度依赖性。此外，罗非鱼鱼糜的氧化程度与烤制后MeIQx的生成量密切相关：轻度至中度氧化(4 d内)显著促进MeIQx形成(最高增加211.81%)，而高度氧化(10 d)因脂质过度降解及感官劣化，反而使MeIQx生成量下降。本研究为脂质氧化产物作为MeIQx形成标志物提供了理论依据，对优化食品加工工艺以降低致癌物风险具有实际意义。未来需进一步探究2-甲基丙烯醛在实际食品体系中的剂量效应，并开发针对性抑制策略。
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